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small RNA 测序

small RNA(包括 miRNAs、siRNAs 和 piRNAs 等)是生命活动重要的调控因子,在基因表达调控、生物个体发育、代谢紊乱及疾病发生和发展等生理过程中发挥重要作用。miRNA 是一类内源性的、长度约 18-25 nt、具有调控功能的非编码 RNA,通过和靶基因碱基配对引导沉默复合体降解 mRNA 或阻碍其翻译。Small RNA 测序技术不受物种限制,既能鉴定特定条件下表达的 miRNA,又能预测发现新的 miRNA,对于疾病的发生发展研究有重要意义。

高度灵活性
可研究任一 17-35 nt 之间的小 RNA 分子
高度准确性
可准确到单核苷酸水平,有利于区分高度同源的小 RNA 分子和鉴定小 RNA 的多态性
检测动力学范围广
可在超过 6 个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析,有利于低丰度小 RNA 差异表达的研究
数据质量高
深度测序保证了抽样随机性、可靠性和重复性,与实时定量 PCR 结果具有较高的一致性
推荐测序模式
●   Hiseq X Ten, PE150    ●   10 M 或 20 M clean reads/样本
案例展示
案例一   轮状病毒编码的病毒样 small RNA 通过 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向 IGF1R 触发宿主细胞自噬
研究背景
轮状病毒是双链 RNA 病毒,它是婴儿病毒性腹泻的主要原因。病毒可以创造一个微环境,通过编码 miRNA 等靶向调控各种宿主细胞的分子来促进其生存和自我增殖。然而,RNA 病毒是否编码 miRNAs 以及其调控机制仍有待于探究。
研究内容
我们携手中国医学科学院医学生物学研究所,发现轮状病毒(Rotavirus, RV)编码的 small RNA RV-vsRNA1755 可以通过 PI3K/Akt/mTOR 通路靶向调控 IGF1R 触发宿主细胞自噬。通过 small RNA 测序分析确定研究对象 RV-vsR-NA1755,发现 RV 感染初期其通过靶向调控 IGF1R 导致 PI3K/Akt/mTOR 通路受到抑制,并触发了细胞自噬,但最终会抑制自噬体的成熟。

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研究结果
1. small RNA 测序发现,Chr17_1755 在 RNV 感染后表达量显著性升高,因此 Chr17_1755 可能是 RV 负责编码的 small RNA。
2. 通过 mirdeep2 预测 Chr17_1755 前体序列并将 PCR 产物与 RV NSP4 基因组比对,确定 RV-vsRNA1755 (Chr17_1755) 来自于 RV,且由 NSP4 编码。
3. 通过 miRanda 靶基因预测、荧光素酶报告实验、qRT-PCR 和 WB 等确定 RV-vsRNA1755 调控 PI3K/Akt 通路中 IGF1R 的表达。
4. 对不同感染阶段 Akt 和 mTOR 的磷酸化水平进行检测发现,在 RV 感染初期,PI3K/Akt/mTOR 通路被抑制,检测细胞自噬水平发现 RV 感染引起细胞自噬。
5. 过表达 RV-vsRNA1755 和沉默 IGF1R 均发现促进了 LC3II 的形成和 P62 的降解,同时细胞自噬水平升高。
参考文献
Zhou Y, Geng P, Liu Y, et al. Rotavirus-encoded virus-like small RNA triggers autophagy by targeting IGF1R via the PI3K/Akt/mTOR pathway. BBA-Mol Basis Dis 2018; 1864(1): 60-68. (IF: 5.476)
常见问题
1. small RNA 测序后进行 RT-PCR 验证时,常会出现非特异性扩增,如何解决?
因为 miRNA 序列比较短,彼此间相似度又非常高,尤其是同一家族的 miRNAs,彼此间可能只有 1 个碱基差异,出现非特异性扩增是很正常的,建议使用 Taqman 探针法进行尝试。
2. 没有参考基因组可否进行 small RNA 测序?
进行生物信息分析时,针对有参考基因组样本,以该物种的基因组以及该物种的 miRBase 数据库为参照进行数据分析;如果没有参考基因组,可以近缘物种的基因组以及近缘物种的 miRBase 数据库为参考,或者动物样本以所有动物的 miRBase 数据库、植物样本以所以植物的 miRBase 数据库为参照进行比对分析。
3. small RNA 测序对样本有什么特殊要求?
为防止 small RNA 丢失,浪费样本、时间和精力,抽提 total RNA 时请使用 miRNA Homogenate Additive。如果同一份样本同时检测 mRNA/lncRNA 和 small RNA,请事先告知该区域负责的销售工程师,请公司抽提人员注意保留 small RNA。