注意事项：

① 解剖小鼠，取其具体靶器官时，一般采取断颈的方式，优势是处理快速、方法通用，但会引起体内局部（尤其是胸腔）内凝血，对心脏、主动脉和肺等组织有一定影响；解剖过程，务必快速准确，尽量减少细胞活性的损失。

② 冲洗过程，一般采用预冷的生理盐水/PBS/D-Hanks`液/RPMI-1640等液体。此步骤注意两点：预冷+维持细胞活性的“液体”。一般情况下，建议RPMI-1640添加FBS至10%终体积（其实就是完全培养液）。也有老师用终浓度1-5%的BSA，其实作用都是为了提高细胞悬液制备过程中的细胞活性。

③ 剪碎过程，注意两点：快速+越小越碎越好。可以准备一次性的平皿，提前注入5-10 ml预冷的完全培养液，在预冷环境中剪碎组织。

④ 胶原酶消化，这一步注意事项较多。首先，明确适用于该组织的胶原酶，详细情况见上面表格；一般情况下，IV型最通用，但特殊类型的组织用单一类型的酶效果更好；另外，根据研究目的，如果样品所处微环境组织类型复杂，可以配成混合型的胶原酶，如II+IV型；第二，使用终浓度，我们整理了20+的CNS文章，发现有作者用质量浓度mg/ml，也有的用活性单位浓度UI/ml，考虑到各公司货品单位质量对应的活性不同，建议以活性单位浓度UI/ml为基准。大多数的II或IV型胶原酶的使用浓度为100-200UI/ml。最后，注意消化时间。一般情况下，胶原酶在37℃条件下活性最强，消化时间为20-30 min；也有文章在处理肿瘤组织时，消化4 h甚至过夜。不敢多想，深表怀疑。另外，也有老师喜欢用4℃消化过夜的方式，细胞数量和活性也都还不错，可以尝试，但可能不会通用于所有类型的组织。

⑤ 终止酶的消化，一般来说都是加入血清的。但是，由于胶原酶本身不受血清影响，因此，只能采用离心—弃上清—加培养液重悬的“素质三连”来洗去残留的胶原酶。至于细胞碎片，这一步基本上都是通过低转速短时间离心的方式进行的，基本上300 g，5 min即可。既保证活细胞离心收集，又保证细胞碎片悬浮在上清中被弃掉。如果，老式离心机只能调节转速（rpm），没有g这一选项的话，一般情况下是1000-1500 rpm。

⑥ 红细胞裂解，这一步其实很纠结。先说结论，该裂还是要裂的，不过尽量在初步分离细胞的时候把红细胞去除干净。不过，像心脏和肝脏这样的组织，本身红细胞含量就超级高，裂红在所难免。至于为什么纠结，因为有些细胞类型被裂红试剂处理后，会发生聚集并收缩在一团，用移液器轻微的吹打不容易将其分开，会影响后续实验的单细胞得率。

⑦ 最终，在检测细胞活性/数量的时候，要么走经典路线，光学显微镜+细胞计数板+台盼蓝；要么走高科技路线，活/死细胞荧光染料染色后全自动计数仪操作。这里不建议用台盼蓝染色，再全自动计数的仪器，贵不贵不是最重要的，关键是不准确，且批次间可重复性太低，低到你崩溃。明明镜下观察活性相当客观，为何全自动说细胞都挂了呢，不思其解。问了周围的小伙伴，以及销售器材的一些朋友，确实也有不少人碰到过这一情况。

最后，给大家提一些单细胞悬液制备的注意事项：

1） 针对具体组织类型选对酶，以及使用浓度；多种类型组织共存，可配置混合型酶反应液；提前摸索活性浓度；

2） 酶干粉配置母液时要含有Ca2+离子才能激活活性；

3） 需要预冷的，需要室温的，或者需要37℃的，都提前准备好。一般情况下，酶消化用37℃，其他分离过程用4℃减少活性损失（包括离心）；

4） 组织剪的越小，分离效果越好；

5） 离心机**是带g的，300 g+5 min通用全程；不带g的话，1000-1500rpm即可，转速过高，细胞活性会受影响，碎片也越多。