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单细胞测序样本准备指南——细胞消化悬浮方案

注意事项:

解剖小鼠,取其具体靶器官时,一般采取断颈的方式,优势是处理快速、方法通用,但会引起体内局部(尤其是胸腔)内凝血,对心脏、主动脉和肺等组织有一定影响;解剖过程,务必快速准确,尽量减少细胞活性的损失。

冲洗过程,一般采用预冷的生理盐水/PBS/D-Hanks`液/RPMI-1640等液体。此步骤注意两点:预冷+维持细胞活性的“液体”。一般情况下,建议RPMI-1640添加FBS至10%终体积(其实就是完全培养液)。也有老师用终浓度1-5%的BSA,其实作用都是为了提高细胞悬液制备过程中的细胞活性。

剪碎过程,注意两点:快速+越小越碎越好。可以准备一次性的平皿,提前注入5-10 ml预冷的完全培养液,在预冷环境中剪碎组织。

胶原酶消化,这一步注意事项较多。首先,明确适用于该组织的胶原酶,详细情况见上面表格;一般情况下,IV型最通用,但特殊类型的组织用单一类型的酶效果更好;另外,根据研究目的,如果样品所处微环境组织类型复杂,可以配成混合型的胶原酶,如II+IV型;第二,使用终浓度,我们整理了20+的CNS文章,发现有作者用质量浓度mg/ml,也有的用活性单位浓度UI/ml,考虑到各公司货品单位质量对应的活性不同,建议以活性单位浓度UI/ml为基准。大多数的II或IV型胶原酶的使用浓度为100-200UI/ml。最后,注意消化时间。一般情况下,胶原酶在37条件下活性最强,消化时间为20-30 min;也有文章在处理肿瘤组织时,消化4 h甚至过夜。不敢多想,深表怀疑。另外,也有老师喜欢用4消化过夜的方式,细胞数量和活性也都还不错,可以尝试,但可能不会通用于所有类型的组织。

终止酶的消化,一般来说都是加入血清的。但是,由于胶原酶本身不受血清影响,因此,只能采用离心—弃上清—加培养液重悬的“素质三连”来洗去残留的胶原酶。至于细胞碎片,这一步基本上都是通过低转速短时间离心的方式进行的,基本上300 g,5 min即可。既保证活细胞离心收集,又保证细胞碎片悬浮在上清中被弃掉。如果,老式离心机只能调节转速(rpm),没有g这一选项的话,一般情况下是1000-1500 rpm。

红细胞裂解,这一步其实很纠结。先说结论,该裂还是要裂的,不过尽量在初步分离细胞的时候把红细胞去除干净。不过,像心脏和肝脏这样的组织,本身红细胞含量就超级高,裂红在所难免。至于为什么纠结,因为有些细胞类型被裂红试剂处理后,会发生聚集并收缩在一团,用移液器轻微的吹打不容易将其分开,会影响后续实验的单细胞得率。

最终,在检测细胞活性/数量的时候,要么走经典路线,光学显微镜+细胞计数板+台盼蓝;要么走高科技路线,活/死细胞荧光染料染色后全自动计数仪操作。这里不建议用台盼蓝染色,再全自动计数的仪器,贵不贵不是最重要的,关键是不准确,且批次间可重复性太低,低到你崩溃。明明镜下观察活性相当客观,为何全自动说细胞都挂了呢,不思其解。问了周围的小伙伴,以及销售器材的一些朋友,确实也有不少人碰到过这一情况。

最后,给大家提一些单细胞悬液制备的注意事项:

1) 针对具体组织类型选对酶,以及使用浓度;多种类型组织共存,可配置混合型酶反应液;提前摸索活性浓度;

2) 酶干粉配置母液时要含有Ca2+离子才能激活活性;

3) 需要预冷的,需要室温的,或者需要37的,都提前准备好。一般情况下,酶消化用37,其他分离过程用4减少活性损失(包括离心);

4) 组织剪的越小,分离效果越好;

5) 离心机**是带g的,300 g+5 min通用全程;不带g的话,1000-1500rpm即可,转速过高,细胞活性会受影响,碎片也越多。