解读10分lncRNA文献 4步法研究lncRNA功能解读10分lncRNA文献 4步法研究lncRNA功能 今天云生物为大家带来网友解读的一篇文章，它发表在2013年6月的《nature communications》上。这篇文章找的目标分子是lncRNA，而且是enhance lncRNA。下面按照文章的思路进行分析。 今天解读的这篇文章发表在2013年6月的《nature communications》上。作者利用二代测序研究了单核细胞系受细菌脂多糖应激后lncRNA的表达变化。然后通过knock out实验验证了两条lncRNA的潜在功能。首先，我们来看看这篇文章的思路，其实功能研究文章的核心思路很简单，只有四步。但是最核心就是第三步：找到目标分子。而这篇文章找的目标分子是lncRNA，而且是enhance lncRNA，最后还证明的确有功能。怎么找目标分子，首先分析文章主线：这篇文章是10分的，内容很多。但文章的主线很简单，只有三步： 1）处理和测序：利用细菌脂多糖处理细胞系，激发炎症反应，然后进行lncRNA测序 2）lncRNA数据的分析：mRNA差异分析 → 找到关键应答的编码基因 → 以编码基因为线索找到候选lncRNA 3）目标lncRNA功能分析与验证这篇研究之所以能发10分关键在于第二步 1）如何将lncRNA 扯到 enhance RNA； 2）如何将从大量lncRNA 中筛选有潜在功能意义的lncRNA接下来，我们就从第二步出发，看看作者是怎么一步步找到目标lncRNA的。文章数据分析主线第二步：lncRNA数据的分析我们都知道，lncRNA是非编码的，要分析推测lncRNA的功能，只能利用编码gene为线索。所以大部分lncRNA功能研究的文章，都符合“mRNA → lncRNA”的逻辑思路。最常用的线索其实也就两条： 1）lncRNA 和关键编码基因的位置关系； 2）共表达关系。由于这个研究只测了两组数据（处理组和对照组），无法计算相关系数，所以mRNA和lncRNA位置关系就是最核心的信息的。那么，作者又是如何找到目标lncRNA的呢？1、RNA-seq结果表明细菌脂多糖引起先天免疫应答一个与炎症反应相关的基因IL1β在炎症反应下表达第二高。文章后续会解释为什么以这个基因为线索找lncRNA。2、lncRNA的分析除了常规的lncRNA差异表达分析， lncRNA与mRNA位置关系分类等内容，文章关键的一点是将lncRNA 和 enhance RNA联系在了一起。（1）enhancer RNA作者尝试判断哪些lncRNA 位于增强子区（enhancer），为潜在enhancer RNA（点击了解enhancer RNA）。小科普：enhancer一般被H3K4me1修饰，而promoter主要被组蛋白H3K4me3修饰。因此H3K4me1/H3K4me3的比例，可以是区分promoter 和enhancer。文章的做法：下载encode chip-seq数据，判断lncRNA是否来源enhancer区域， 最后以H3K4me1/H3K4me3 比例为大于1.2 和或小于0.8，判断lncRNA来源enhancer还是启动子。（2）双向转录本当然，文章还顺带分析了一下，看看哪些lncRNA是双向转录本（RBT）小科普：大部分转录本都只从一条链转录组，而双向转录本是两条链均转录组（3）差异表达的lncRNA的被关键转录因子调控NFkβ是一种与炎症反应相关的转录因子，作者通过分析发现，差异表达mRNA、can-lncRNA、eRNA的promoter区普遍存在NFkβ的结合位点。3、目标lncRNA的选择作者特别关注了与编码基因——炎症介质因子IL1β相邻（距离 < 5k）的两条lncRNA，一条为RBT，一条为enhancer RNA；选择编码基因IL1β为线索，筛选候选lncRNA的原因：a）在炎症条件下， IL1β表达第二高；b） IL1β之前的研究表明，在炎症应答反应中很重要；c）周边有两条差异表达的lncRNA，而且一条是enhancer RNA，一条是RBT。第三步、lncRNA的功能分析1）用多点QPCR的方法，证明两个lncRNA与其1L1β表达量的相关性（虽然二代测序的样本过少，不足以进行相关性就计算，但可以使用Qpcr补充）；2）用CHIP-QPCR证明，在炎症条件下关键转录因子NFkβ可以结合在两个lncRNA的promoter区。3）确定两个lncRNA起作用的亚细胞位置；4）采用knock down技术验证两个lncRNA对IL1β表达的影响；小 结这篇文章是典型的lncRNA功能分析文章，有几点值得我们借鉴的：1）以mRNA为线索，找lncRNA，是lncRNA功能研究的主要思路。当然，实际研究的时候，可能也无法做到一发命中。所以多选几个候选lncRNA，可以更好的的验证出一个有重要功能。2）lncRNA后期功能验证，思路和编码基因是相似的，工作量自然也相似。但从现在研究热点来说，发现新的有功能的lncRNA，发高分文章的概率要更大。所以，老师只要经费许可，建议进行lncRNA测序，这样既可以分析样本中mRNA，又可以分析lncRNA，得到更多的信息。3）这篇文章由于测序样本较少，所以只利用了lncRNA和mRNA的位置关系，即潜在的顺式作用（cis）。如果要研究非相邻的lncRNA与mRNA的关系，则要考虑使用多样本构建共表达网络，寻找潜在的反式作（tans）关系。后续的文章解读中，我们会继续分享这样的案例。 |
