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样本要求
应用案例

5hmC-Seal,超高灵敏度的羟甲基化检测

羟甲基化5hmC是被认为是哺乳动物基因组上的第六碱基,在发育、衰老、神经退行性疾病、复杂疾病及肿瘤发生过程中起重要作用;

并且在最近几年5hmC已经作为一种重要癌症筛查标志物的研究,具有重要的临床价值;

5hmC化学捕获测序(5hmC-Seal)通过点击化学、生物素标记捕获等原理(Nat Biotechnol. 2011;29(1):68-72),

减少了基于亚硫酸盐测序对DNA损伤,降低了DNA输入量的要求,

满足不同样本类型包括血浆cfDNA的全基因组范围羟甲基化检测;

广泛用于: 1) 发育和疾病甲基化机制研究; 2) 复杂疾病与肿瘤分子分型与诊断预后; 3) cfDNA羟甲基化检测、液体活检等临床应用。

核心技术及质控,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的羟甲基化完整解决方案;

较早开发羟甲基化测序技术的团队之一, 国内首家推出多种组合的羟甲基化解决方案;

从样本采集、cfDNA提取、建库测序的完整cfDNA羟甲基化检测方案;

低至5ng血浆cfDNA的5hmC Seal文库构建核心技术;

自动化样本处理、建库及分析流程,保障高效周期,40天极速交付;

已完成多种肿瘤组织、cfDNA及哺乳动物羟甲基化测序及分析;

助力客户在Genome biology, Epigenetics等杂志发表多篇论文。

样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 3ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

血浆/血清/cfDNA

建议提供2-4ml血浆/血清, 或者>15ng cfDNA

细胞、全血、动物组织等

按照送样要求准备

备注:用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

Seal-seq

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

测序Reads 在基因组上的分布

3、5hmC Peak峰Calling

5hmC富集区域鉴定

4、5hmC Peak图谱分析

5hmC Peak在基因组,染色体,功能元件上的分布

6、组间差异5hmC Peak分析

寻找DhMR及注释

7、差异5hmC Peak基因分析

相关基因GO,KEGG富集分析

高级分析

8、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

9、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘


5hmC化学捕获测序(Seal-Seq)送样要求

一、   送样类型

基因组DNA、细胞、全血、动物组织二、保存方式

基因组 DNA、细胞、全血、组织样本:放-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内);保存期间避免反复冻融。

三、   运输条件

1、基因组 DNA:冰袋或者干冰运输 (推荐干冰运输);

2、细胞、全血、组织样本:干冰运输,顺丰陆运(3-4天时间),夏季 10-15公斤干冰;秋冬季 10公斤干冰;

四、   样本量要求

1、基因组 DNA:总量不少于 3ug,浓度不低于30ng/ul

1)   提供样本 DNA完整性质检结果,例如琼脂糖凝胶电泳或者 Agilent 2100电泳等;

2)   提取基因组 DNA,要加 RNA酶,去除 RNA污染;

3)   提取基因组 DNA,溶到 TE或者 elutionbuffer, 避免溶解到纯水;

4) 提供 Qubit检测浓度,基于 OD值的检测方法,例如 NanoDrop, 会严重高估浓度。

2、细胞样本:不少于 5x10*6个细胞

1)   收集贴壁或者悬浮细胞、使用预冷的 1×PBS,洗涤 2次,600g离心 5分钟;

2) 最后一次离心后,尽量去除上清 PBS,保留细胞沉淀;

3、全血样本:1-5ml外周血

1)使用普通 EDTA抗凝管,避免使用肝素抗凝管。

4、动物组织:30mg以上

用预冷的 1×PBS溶液洗掉组织表面残留的血液;取不少于 30mg(绿豆大小)组织块,放置-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内);

案例分析1:基于血浆游离DNA的5-羟甲基胞嘧啶检测用于肝癌早期诊断

Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosines in circulating cell-free DNA as a non-invasive approach for early detection of hepatocellular carcinoma. Gut. 2019 Jul 29.

研究方案:本文研究者应用5hmc-seal技术,对2554个中国人cfDNA样本进行了全基因组5hmC检测, 包含1204个肝癌及392个慢性乙肝炎病毒感染或肝硬化患者和958个健康人。

研究结果:通过病例对照分析,建立了早期肝癌的诊断模型。基于巴塞罗那临床肝癌分期系统,建立了一个32基因诊断模型,能准确地区分早期肝癌(0/a期)和非肝癌,同时很好的区分早期肝癌和有CHB或IC病史的高危患者(AUC=84.6%, 95% CI 85.8% to 91.1%);此外,5hmC诊断模型似乎与潜在的混杂因素, 如吸烟/饮酒史无关。因此,这种方法在早期发现肝癌方面具有临床应用潜力。


案例分析2:胰腺癌羟羟甲基化改变并调控癌症基因通路

Altered hydroxymethylation is seen at regulatory regions in pancreatic cancer and regulates oncogenic pathways. Cell Research. 2017;27(11):1830-1842.

研究方案:5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)是一种表观遗传修饰,在胰腺癌中尚未被研究。在一组低代胰腺癌细胞系、原发性患者来源的异种移植细胞和胰腺对照组组织中用5hmC-seal技术进行5hmC全基因组测序分析;

研究结果:

1、差异羟甲基化区域优先影响已知的基因组调控区域,特别是与已知的H3K4me1增强子重叠。

2、此外,通过氧化亚硫酸氢盐测序对胞嘧啶甲基化和羟甲基化进行单碱基分辨率分析,并通过ATAC-seq检测染色质可及性以及通过RNA-seq检测基因表达,研究发生5hmC在染色质开放区域特异性富集,与胰腺肿瘤相关的致癌途径,如MYC、KRAS、VEGFA和BRD4有关;

3、在大多数肿瘤样本中,BRD4在增强子区域过度表达并获得5hmC修饰;

4、在功能上,BRD4启动子5hmC水平上升与其转录表达水平增加有关;

5、而阻断BRD4抑制体内胰腺癌生长。综上所述,5hmC的重新分布和癌基因增强子的优先富集是胰腺癌的一种新的调控机制。