oxWGBS送样要求

一、   送样类型

基因组DNA、细胞、全血、动物组织二、保存方式

基因组 DNA、细胞、全血、动物组织：放-20℃冰箱中保存(2 年以内)，或者放-80℃冰箱中长期保存(5 年以内)；保存期间避免反复冻融。

三、   运输条件

1、基因组 DNA：冰袋或者干冰运输；

2、细胞、全血、组织样本：干冰运输，顺丰陆运（3-4 天时间），夏季 10-15 公斤干冰；秋冬季10 公斤干冰；

四、   样本量要求

1、基因组DNA：总量不少于4ug，浓度不低于 25ng/ul

1）提供样本 DNA完整性质检结果，例如琼脂糖凝胶电泳或者Agilent2100电泳等；

2）提取基因组 DNA，要加 RNA酶，去除 RNA污染；

3）提取基因组 DNA，溶到 TE或者 elutionbuffer,避免溶解到纯水；

4）提供 Qubit检测浓度，基于OD值的检测方法，例如 NanoDrop,会严重高估浓度。

2、细胞样本：不少于10*7个细胞

1）收集贴壁或者悬浮细胞、使用预冷的 1×PBS，洗涤 2次，600g离心 5分钟；

2）最后一次离心后，尽量去除上清 PBS，保留细胞沉淀;

3、全血样本：2-5ml外周血

使用普通 EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。

4、动物组织：动物组织，60mg以上

动物组织：用预冷的 1×PBS溶液洗掉组织表面残留的血液；取不少于 60mg（绿豆大小）组织块，放置-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中长期保存(1 年以内)；

oxRRBS送样要求

一、   送样类型

基因组DNA、细胞、全血、动物组织

二、保存方式

基因组 DNA、细胞、全血、动物组织：放-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内)；保存期间避免反复冻融。

三、   运输条件

1、基因组 DNA：冰袋或者干冰运输；

2、细胞、全血、动物组织：干冰运输，顺丰陆运（3-4天时间），夏季 10-15公斤干冰；秋冬季 10公斤干冰；

四、   样本量要求

1、基因组 DNA：总量不少于 2ug，浓度不低于 25ng/ul

1） 提供样本 DNA完整性质检结果，例如琼脂糖凝胶电泳或者Agilent 2100电泳等；

2）   提取基因组 DNA，要加 RNA酶，去除 RNA污染;

3）   提取基因组 DNA，溶到 TE或者 elutionbuffer, 避免溶解到纯水；

4）   提供 Qubit检测浓度，基于 OD值的检测方法，例如 NanoDrop, 会严重高估浓度。

2、细胞样本：不少于 5x10*6个细胞

1） 收集贴壁或者悬浮细胞、使用预冷的 1×PBS，洗涤 2次，600g离心 5分钟；

2）   最后一次离心后，尽量去除上清 PBS，保留细胞沉淀;

3、全血样本：2-5ml外周血

1）使用普通 EDTA抗凝管，避免使用肝素抗凝管。

4、动物组织：60mg以上

动物组织：用预冷的 1×PBS溶液洗掉组织表面残留的血液；取不少于 60mg（绿豆大小）

组织块，放置-20℃冰箱中保存，或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内)。

案例分析1：肺癌和肝癌的全基因组甲基化和羟甲基化分析

Whole-genome analysis of the methylome and hydroxymethylome in normal and malignant lung and liver. Cell Research. 2016;26(12):1730-1741.

一、研究背景：DNA甲基化(5mC)是一种表观遗传修饰，在发育和疾病中调节基因表达和细胞可塑性。TET基因家族将5mC氧化为5-羟基甲基胞嘧啶(5hmC)，提供了一种主动去甲基化机制，并具有自身的调控功能。本课题应用氧化亚硫酸氢盐测序技术，绘制肝癌和肺癌(4对肝癌+3对肺癌)全基因组范围的单碱基分辨率的甲基化和羟甲基化图谱，结合转录组测序。研究发现在组织分化和肿瘤发生过程中，通过甲基化、羟甲基化和组蛋白修饰的相互作用，存在复杂的基因表达调控。

二、方法流程

1、取材：癌及癌旁组织(4对肝癌+3对肺癌)

2、测序：全基因组氧化亚硫酸盐测序(WGBS + oxWGBS)、转录组测序(RNA-Seq)

三、研究结果

1、应用氧化亚硫酸盐测序(oxBS-seq)技术得到了正常肝脏和肺以及成对的肿瘤组织中全基因组DNA甲基化和羟甲基化图谱;

2、研究发现, 在活跃的基因中5hmC在CpG Island shore中呈显著富集状态，而在CpG Island中则呈稀缺状态;

3、启动子、基因体和转录终止区域的羟甲基化分析显示，5hmC与基因表达有很强的正相关，这表明5hmC是活跃基因的标记;

4、甲基化和羟甲基化的比较分析表明，在组织特异性DMR和癌症特异性的DMR中，5hmC显著地富集，而且5hmC与甲基化的变化呈负相关，特别是在非CpG Island相关的DMR中。

四、研究结论

在组织分化和肿瘤发生过程中，通过甲基化、羟甲基化和组蛋白修饰的相互作用，存在复杂的基因表达调控。

案例分析2：肝星状细胞转分化涉及DNA甲基化景观的全基因组重塑

Hepatic stellate cell transdifferentiation involves genome-wide remodeling of the DNA methylation landscape. J Hepatol. 2016;64(3):661-73.

研究者采用简化基因组氧化-亚硫酸盐测序(RRBS/oxRRBS)检测静止和活体激活状态的大鼠HSC细胞的5mC和5hmC水平，证实了5mC和5hmC在肝纤维化和HSC转分化过程中的整体变化，表明DNA甲基化/羟甲基化是HSC激活的关键步骤，可能会为支持纤维生成的分子事件带来新的见解，并可能为疾病进展提供生物标志物以及潜在的新药物靶点。

案例分析3：中通量亚硫酸盐测序准确检测5mC和5hmC

Medium throughput bisulfite sequencing for accurate detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine. BMC Genomics. 2017;18(1):96.

DNA的表观遗传修饰5mC和5hmC在发育和疾病中起着重要作用。本课题通过多重PCR靶向区域的亚硫酸盐测序(Targeted BS-Seq, TBS)和靶向氧化-亚硫酸盐测序(Targeted oxBS-Seq, oxTBS)，用于分析478个样本的目标基因组区域DNA甲基化和羟甲基化水平，获得了单碱基分辨率的5mC和5hmC数据。结果表明该方法能够以较低的成本在大样本中进行甲基化和羟甲基化检测，可以广泛用于多种科研及临床候选基因的甲基化和羟甲基化检测，或者用于全基因组分析后的差异甲基化和羟甲基化区域的验证。