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项目简介
样本要求
应用案例

目标区域甲基化测序(Targeted Bisulfite Sequencing)

除了全基因组甲基化测序技术等研究手段,对于目标基因/CpG位点甲基化检测,需要灵活的靶向甲基化测序方案,

基于亚硫酸盐多重PCR捕获核心技术和NGS高深度测序的目标区域甲基化测序Targeted Bisulfite Sequencing,

满足几个到上百个基因/CpG位点的检测, 具有高准确性、高通量、低成本、快周期的优势,

广泛用于临床样本多位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用。

技术优势

基于亚硫酸盐多重PCR扩增捕获测序;

高效灵活的目标区域甲基化检测方案;

NGS高深度测序,单碱基分辨率,绝对定量的;

适合几个到几百个区域/CpG位点同时检测;

适合广泛的样本类型:血液、组织、病理切片、灌洗液、粪便等;

低成本、快周期的,超高性价比优势;

核心技术,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

最早开发TBS技术团队之一, 国内首家推出靶向甲基化TBS定制化服务;

已经完成血液、组织、病理切片、粪便等多种类型,10000+例样本TBS项目经验;

核心团队在Genome biologyDNA Res等杂志发表多篇SCI论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。

样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 200ng; 浓度≥ 10ng/ul; 基于Qubit定量

细胞、血液、新鲜冷冻组织等

按照送样要求准备

备注用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

TBS

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与目标区域序列比对

统计覆盖度分析

3、CpG位点甲基化水平统计

评估胞嘧啶甲基化状态

4、不同样本间甲基化水平比较

统计甲基化差异

高级分析

5、临床病理信息分析

甲基化与临床信息关联分析


TBS(TargetedBisulfiteSequencing)送样要求

一、    送样类型

基因组 DNA、细胞、全血、动物组织、 FFPE、肺泡灌洗液、尿液及粪便等

二、    保存方式

1 、基因组 DNA 、细胞、全血、动植物组织:放-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内);保存期间避免反复冻融。

2、FFPE 样本:室温保存

三、    运输条件

1、基因组 DNA:冰袋或者干冰运输;

2 、细胞、全血、组织样本: 干冰运输,顺丰陆运(3-4 天时间),夏季 10-15公斤干冰;秋冬季 10 公斤干冰;

3、FFPE 样本:室温运输。

四、    样本量要求

1、基因组DNA:总量不少于500ng,浓度不低于10ng/ul。

1)提供样本 DNA完整性质检结果,例如琼脂糖凝胶电泳或者Agilent2100 电泳等; 2)提取基因组DNA,要加RNA 酶,去除 RNA 污染;

3)提取基因组 DNA,溶到 TE 或者elutionbuffer,避免溶解到纯水;

4)提供 Qubit检测浓度, 基于 OD值的检测方法,例如 NanoDrop, 会严重高估浓度。

2、细胞样本:不少于1x10*6   个细胞

1 )收集贴壁或者悬浮细胞、 使用预冷的1 ×PBS,洗涤 2 次,600g   离心5 分钟;2)最后一次离心后,尽量去除上清 PBS,保留细胞沉淀;

3、全血样本:0.2-5ml外周血

使用普通 EDTA 抗凝管,避免使用肝素抗凝管。

4、动物组织:10mg以上

用预冷的 1 ×PBS   溶液洗掉组织表面残留的血液; 取不少于 30mg (1/2 绿豆大小) 组织块,放置-20℃冰箱中保存,或者放-80℃冰箱中长期保存(1年以内);

5、FFPE样本:不少于0.5ug

案例分析1DNA甲基化异常用于甲状腺结节诊断

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551.

本课题通过RRBS检测了109个甲状腺组织的DNA甲基化,发现癌旁、良性结节和癌组织之间存在显著差异,并在65个甲状腺结节的回顾性队列样本中得到验证。这些组织特异性DMR与活性增强子和癌症相关基因密切相关,表明DNA甲基化为甲状腺结节提供准确的诊断。并开发及验证了基于靶向甲基化测序TBS (Target Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位点甲状腺结节诊断的转化应用方案的重要价值。

案例分析2:血清游离DNA甲基化biomarker用于乳腺癌转移早期筛查

Methylation patterns in serum DNA for early identification of disseminated breast cancer. Genome Med. 2017;22;9(1):115.

本课题通过RRBS检测了31个样本,其中癌组织(n=8)和白细胞(n=23)的DNA甲基化,筛选出18个癌症特异的DMR, 进一步通过TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 在两个样本库(>1000例)的血浆cfDNA中验证,找到血清EFC#93用于早期识别弥散性乳腺癌的biomarker.

案例分析3:循环肿瘤DNA甲基化biomarker用于肝癌诊断和预后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

本课题通过TCGA数据库筛选401个甲基化Biomarker, 在1933例血浆中进行基于靶向亚硫酸盐测序(Targeted Bisulfite Sequncing, TBS) ,通过与临床样本信息进行关联分析,最终筛选了10个HCC诊断和8个HCC预后预测的甲基化Biomarker.

案例分析4:乳腺癌中48个基因甲基化普研究

Methylation profiling of 48 candidate genes in tumor and matched normal tissues from breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2015;149(3):767-79.

PubMed文献检索与癌症相关的48个基因,180例乳腺癌患者配对的癌和癌旁组织样本库中,通过TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 检测这48个基因的启动子甲基化,寻找有价值的甲基化标记物;结果聚类分析筛选出13个基因(CST6、DBC1、EGFR、GREM1、GSTP1、IGFBP3、PDGFRB、PPM1E、SFRP1、SFRP2、Sox17、TNFRSF10D和WRN)为候选生物标志物,构建乳腺癌高效率的癌症预测模型。

案例分析5:靶向亚硫酸盐测序发现食管鳞癌甲基化biomarker

Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).Clin Epigenetics. 2017. 15;9:129

基于TCGA数据库(450K芯片)等数据,**步筛选了5个潜在甲基化biomarker,第二步通过TBS (Target Bisulfite sequencing) 在94对ESCC样本中验证和评估,由5个CpG位点Panel的诊断模型具有很好的指标(sensitivity=0.75, specificity=0.88, AUC=0.85)