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外泌体简介
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外泌体(exosomes)是一种能被机体内大多数细胞分泌的直径大约为30-150nm的具有脂质双层膜的微小膜泡。它广泛存在并分布于各种体液中,携带和传递重要的信号分子,形成了一种全新的细胞间信息传递系统,影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生与进程密切相关。2013年,发现细胞囊泡运输的调节机制的科学家们,荣获了当年诺贝尔生理学或医学奖。作为人体内一类重要囊泡,外泌体已成为科研热点。

几乎所有类型的细胞都可以分泌外泌体,同时外泌体也广泛存在于体液中,包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水等。目前研究发现外泌体中富含核酸(microRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白、胆固醇等。外泌体的表面marker主要有CD63、CD81、CD9、TSG101、HSP27等。

外泌体主要功能

外泌体内含有大量蛋白质、脂质、DNA、RNA,可调节多种生理或病理反应,包括有血管生长,肿瘤细胞侵袭与转移、免疫应答等。由于miRNA在基因表达调控上有着重要作用,exosome中的miRNA收到更多的关注。外泌体miRNA通过循环囊泡传递信息,被认为是细胞间信号交流的第三种途径。除了miRNA外,研究表明外泌体中circRNA、lncRNA和蛋白质也参与细胞内的信号调控。


参考文献:

1、

Extracellular Vesicles Long RNA Sequencing Reveals Abundant mRNA, circRNA, and lncRNA in Human Blood as Potential Biomarkers for Cancer Diagnosis,Clin Chem,65(6),798-808,jun2019.

2、

Plasma Extracellular Vesicle Long RNA Profiling Identifies a Diagnostic Signature for the Detection of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma,gut,2019 sep27.

1. 实验流程

Exosome-RNASeq文库构建主要包括以下几步:外泌体RNA抽提,采用exoRNeasy Serum/Plasma Maxi kit (Qiagen),根据kit操作步骤,直接得到外泌体RNA,采用Bioptic Qsep100进行质检;进行去除基因组DNA,去核糖体微量RNA建库,经过质检,上机测序

2. 信息分析流程

获得测序原始数据(RawData)后,首先需要对数据进行过滤、去接头序列及对低质量reads进行处理,再对测序质量进行评估,重复检验获得高质量数据(CleanData)。并将CleanData与参考基因组进行比对,对已知mRNA和lncRNA进行定量分析;未比对上的reads采用ACFS分析环状RNA(参考NatNeurosci.2015;18:603-10)。并进行差异基因或宿主基因的功能和通路分析。

1、血浆

(1)建议早晨空腹抽血;

(2)抽全血约8mL到EDTA抗凝采血管(紫色 9mL EDTA真空采血管),注意是抗凝管,不是促凝管;

(3)抽血后3小时内分离血浆,将全血3000 rpm 室温(或4度)离心10 分钟;

(4)收集上清至2.0 mL EP管(或1.5 mL)离心管中,4℃ 13000 rpm 离心10 min,收集上清血浆分装转移至2 ml可立螺旋盖EP管(Corning或BD的)中;

(5)置-80℃长期保存。

送样量**在1ml以上。如直接送全血样品,建议送样量在2ml以上。

2、细胞上清

常规离心(3000g 4度离心 10min),再0.22um过滤。

送样量**在40ml以上。







细胞上清样品通过引物检测支原体污染。

目前对于外泌体的鉴定主要有四种方法:透射电子显微镜(TEM)、Nanosight、Western Blot、流式细胞术。


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exoRBase由云生物平台协助复旦大学上海肿瘤研究所黄胜林研究员团队构建,该数据库于2018年1月发表在Nucleic Acids Research杂志,文章题为:exoRBase: a database of circRNA, lncRNA and mRNA in human blood exosomes(下图)

exoRBase是人类血液外泌体的RNA-seq数据分析的circRNA、LncRNA和mRNA的存储库,还包括已发表文献的实验验证。exoRBase对标准化RNA-seq数据的RNA表达谱进行了整合和可视化,数据涵盖了正常个体和不同疾病患者。数据库网址:http://www.exoRBase.org,网页打开如下图。

数据库网站截图

exoRBase数据库收集和描述人类血液外泌体中所有长的RNA,目前包含58330个circRNA15501个LncRNA18333个mRNA,提供了注释、表达水平和可能的来源组织,数据库将定期更新,提供更多的外泌体RNA信息。

数据库收录的样本包括健康对照者32例,冠状动脉心脏疾病(CHD)6例,结肠癌(CRC)12例,肝细胞癌(HCC)21例,胰腺腺癌(PAAD)14例,乳腺癌2例。所有收集到的数据都经过相同的预处理。除此之外,还分析了LncRNA和mRNA在人类组织中的组织特异性,以及circRNA的来源等。每种疾病所对应的各种RNA分子数目如下表:

数据库提供了多种检索途径,可分别检索circRNA和LncRNA或mRNA,还可以通过标本类型、基因类型、组织表达特异性信息等检索选项进行有针对性的检索。

exoRBase数据库概览

数据检索单个基因的界面中可以呈现基因的折线图、热图、基因的概要信息、框图及详细描述等等。

exoRBase数据库为外泌体研究提供了非常好用的查询平台,数据库还提供了数据下载和上传接口,给外泌体领域的研究带来很大的便利。