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降解组

  鉴定microRNAmiRNA)调控的靶基因是阐释miRNA复杂调控机制的关键。在生物体内,miRNA除了抑制mRNA的翻译外,也会诱导mRNA被剪切降解,从而调控基因表达,发挥生物学功能。相比于动物,在植物中miRNA诱导基因剪切降解的方式会更为普遍。降解组测序正是利用高通量测序技术结合生物信息学手段对这些mRNA降解片段进行大规模鉴定,进而鉴定miRNA调控靶基因的技术。该技术既摆脱了仅利用生物信息学预测靶基因带来的高假阳性,又避免了常规靶基因鉴定手段(如5 RACE)低通量耗时耗力的不足,显著促进了miRNA的功能研究。


降解组原理


技术优势

     通量高:一次降解组测序即可鉴定出成百上千条miRNA作用的靶基因,远胜于传统的5RACE方案

    数据质量高:提供Q30PhredScore)以上数据,确保数据分析的准确性

    数据分析软件优:拥有自主开发的数据分析软件ACGT301-DEG101,并结合CleaveLand,可靠性已经过大量实验项目检验

     文库构建快速可靠:使用全新优化的文库构建方案使得样本起始量更少、建库步骤更简单、测序读长更长,同时PCR扩增次数和割胶纯化次数更少,因而能够更真实地反映样本降解组的丰度,进一步提高实验数据的准确性。


服务流程

   1.个性化测序方案设计

 根据用户的实验要求,设计适合的测序方案


   2.样品制备与检测

  采用适合样本特性的总RNA制备方案(接受用户提供总RNA
  NanoDrop测定样本纯度
  2100 Bioanalyzer测定样本完整度


   3.文库制备

  回收降解片段
  连接接头
  反转录和PCR扩增
  PAGE纯化,用于上机测序


    4.上机测序

    HiSeq2000上机测序(36 SE测序策略)


    5.标准数据分析

 测序数据产出统计,鉴定mRNA降解片段,绘制降解组密度文件,miRNA靶基因鉴定和注释,绘制T-plot


    6.进阶数据分析

 满足用户个性化需求,协商提供进阶数据分析


样品要求

 样本类型:完整无DNA污染的总RNA*

    样本起始量(单次):≥ 20 μg /样本。若您的样品量不足,请咨询技术支持。

 样本浓度:建议介于100~200 ng/μL

 样本纯度:O.D. 260/280 1.8~2.0O.D. 260/230 1.8

    样本完整度:RIN 7Ratio 28S/18S 0.7;某些来源样本(如体液样本,昆虫样本,水生生物样本等)无RINRatio28S/18S要求

   *我们为您提供高质量的样本Total RNA抽提服务


服务周期

 标准流程的服务周期约为60个工作日。


案例分享

案例一:使用降解组测序鉴定野生大豆miRNA调控的靶基因

Zeng QY, Yang CY, Ma QB, Li XP, Dong WW, Nian H. (2012) Identification of wild soybean miRNAs and their target genes responsive to aluminum stress. BMC Plant Biol, 12(1), 182.

作者使用降解组测序技术并结合小RNA测序技术对铝胁迫下的野生大豆miRNA及其调控的靶基因展开研究,共鉴定出已知miRNAs的86个靶基因和新发现miRNA的5个靶基因。上图为miR319剪切靶基因的t-plots图。


案例二:使用降解组测序鉴定小鼠miRNA以剪切方式调控的靶基因

Bracken,C.P., Szubert,J.M., Mercer,T.R., Dinger,M.E., Thomson,D.W., Mattick,J.S., Michael,M.Z. and Goodall,G.J. (2011) Global analysis of the mammalian RNA degradome reveals widespread miRNA-dependent and miRNA-independent endonucleolytic cleavage. Nucleic Acids Res., doi:10.1093/nar/gkr110.

  作者使用降解组测序技术鉴定出成年小鼠组织中16个可能的miRNA剪切靶基因,其中miR-151-5p介导剪切N4BP1和let-7b介导剪切2410001C21Rik是最为显著的,如上图所示。