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靶向蛋白组学
靶向蛋白组学

Targeted proteomics

靶向蛋白质组学针对性地分析复杂样品中的特定肽段,既可以判断肽段或蛋白在样品中的有无(前提是信号高于检测限),又可以对不同样品中的肽段或蛋白进行定量,用于表达差异比较。靶向蛋白质组学可以看做是新一代基于质谱的western blot技术,但是比传统的WB更准确,且不需要抗体。我们一般是基于Orbitrap质谱仪进行分析。

该方法的采集目标是由目标蛋白酶解得到的肽段,因此选取目标肽段和合适的采集方法很重要。如果您有意向做靶向蛋白质组学但是又不了解该如何做,请详询我们的技术支持。

产品介绍
The service content

L-WB(PRM技术)靶向蛋白组学


L-WB(PRM)技术是一项蛋白质定量技术,该技术以质谱平行反应监测技术(Parallel reaction monitoring, PRM)为核心,集样品特殊处理及分析于一体,具有特异性强、灵敏度高、准确性高等特点,能够批量进行蛋白质定量分析,是进行蛋白质定量的一种技术。

实验原理

PRM技术是一种根据已知实测信息或质谱检测规律的假定信息对样品中的蛋白质进行靶向定量的技术。该技术主要应用仪器为Q Exactive系列质谱仪,首先以四极杆作为质量过滤器,特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子(母离子)通过,随后在高能碰撞池中碎裂母离子,最后通过Orbitrap分析碎片离子(子离子)得到肽段的二级质谱信息。四极杆的高选择性离子过滤与Orbitrap高分辨率测量技术的结合使得PRM技术有很高的特异性,并且有效的降低了背景噪音,去除了干扰离子,提高了灵敏度。在确保数据质量的前提下,为了在一次分析中检测更多的蛋白质,可用预置PRM(Scheduled PRM, sPRM)的方法,这种方法需要知道每个肽段的保留时间信息,使得每个肽段只在其洗脱时间窗口内执行PRM检测,大大提高了检测效率,可同时检测上百种蛋白质。PRM技术是目前应用较广泛的质谱蛋白质靶向定量技术。

技术的特点

蛋白质印迹(Western blot)等基于抗体的传统蛋白质定量技术,通过抗体识别并结合目标蛋白,定量检测抗体的含量,可间接反映目标蛋白质的含量。然而制备抗体耗费时间且价格昂贵,抗体的效价不好则会严重影响定量结果的准确性。与之相比,L-WB技术以PRM质谱技术为核心,直接对目标分子进行定量,该技术无需抗体,可以满足大部分生物学样品的蛋白质定量测试需求。特异性方面,PRM技术通过四级杆特异性地选择特定母离子通过,可排除质荷比不同的干扰母离子,并可通过对比参考库二级离子信息、肽段保留时间信息和数据搜库等方法,对鉴定到的肽段加以确认,这使得PRM技术有很高的特异性,甚至可对氨基酸突变和蛋白质修饰位点加以验证和定量。灵敏度方面,因使用高分辨率和高精确性的质量分析器Orbitrap,PRM技术的灵敏度可达到0.2fmol,L-WB技术中的样品分馏技术(包括多维分馏、亲和富集、高丰度蛋白去除等)可进一步提高PRM灵敏度,对于测定复杂样本中的低丰度蛋白有很好的效果。相比之下,目前多数商品化抗体难以达到特异性识别靶蛋白的效果,且抗体效价不高导致其灵敏度普遍难以达到PRM的水平。通量方面,sPRM可同时对近百种蛋白质进行定量,而Western blot只能检测一种蛋白质。此外Western blot实验存在HOOK效应,即抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象,而L-WB技术则无此干扰,且具有良好的重现性。该技术的优势使得其特别适用于组学结果的验证和筛选差异蛋白,以及新蛋白(突变)的确证、蛋白质修饰位点的确证与定量等诸多应用。

应用领域

细菌磷酸化蛋白组学重现性检测

组氨酸修饰定量检测

大鼠酰肉碱定量检测

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实验流程

仪器设备

Thermo Q-Exactive高分辨质谱


1、PRM技术跟MRM技术有什么区别,优势有什么?

PRM技术与MRM技术很相似。先说一下相同点,两种技术在一级质谱中筛选目标蛋白的原理是一样的,都是通过四级杆进行母离子的筛选从而进行下一步的检测;不同点也很容易理解,MRM技术是在母离子碎裂后检测特异的子离子,通过母离子-子离子这种一一对应的离子对形式进行蛋白的定性定量,PRM技术是在母离子碎裂后通过高分辨检测器对全部子离子进行检测,这是PRM技术与MRM技术的不同。由于二级质谱检测模式的不同,在准确定性定量上,PRM技术比MRM技术更为准确,受到的离子干扰远小于MRM技术。

PRM技术的优势是更加简便,只需选择出母离子的质荷比,电荷数即可进行检测,不需要寻找准确的母离子-子离子对进行检测。

2、PRM实验的主要步骤有哪些,主要采用哪些仪器,检索的软件及常用数据库有哪些?

实验步骤包括:蛋白提取、浓度测定及 SDS-PAGE 凝胶检测,质检报告;蛋白酶解、除盐,冻干机冻干;高分辨 LC-MS/MS 质谱DDA检测,搜库定性,选择母离子,高分辨 LC-MS/MS 质谱PRM检测,定量分析,完整报告整理。

质谱仪器有:Thermo 公司QE-HF/QE+/QE-HF-x等。

常用的数据库有:Uniprot数据库、NCBI数据库、本地自建数据库。

PRM数据处理软件:SpectroDive;Skyline