作为强有力的转录组分析工具，RNA测序已经被应用到众多研究项目中，并且很有希望将其应用范围进一步扩展到诊断与治疗领域中。为保证分析的有效性，实验室测试必须提供可重复性和稳定性俱佳的精准信息。Makers和质控品是**可以准确无误的判定实验可靠性的方式。Lexogen公司研发的SIRVs可以评估转录组测序实验的质量和数据可比性。

产品优势
通用的标准品，用于比较分析和监控整个RNA测序实验；
验证RNA测序流程，发现测序错误的来源和偏差，改善RNA测序从建库到数据分析的整个流程；
兼容所有的测序平台，各种生物来源的RNA，甚至单细胞水平的RNA；
通过综合设计，全面代表isoform和转录组丰度的复杂性；
提供三套不同的标准品（SIRV 1,2,3），适用于复杂的isoform表达分析以及简单的样品之间的比较。

工作流程
Spike-In RNA Variant（SIRV）对照质控品是人工转录本，全面代表了转录组的复杂性，实验过程中将其掺入样品（匀浆组织/细胞或纯化的RNA）中，标准品的数据量占总reads数的1-2%。通过SIRV的数据分析，可以评估RNA测序过程的精度和准确性，以确定每个处理样本的技术噪音（Fig.1，评估）。然后根据质量评测和偏差系数来计算实验之间的一致性（Fig. 1，比较）。

Figure 1 | RNA测序中SIRV对照质控品的使用。SIRV是人工合成的RNA分子，可以模拟转录组的复杂性。文库制备之前，将SIRV质控品以极少量的添加到样品中，与样品中的RNA一起进行建库。将测序数据与基因组和SIRVome的序列进行比对，SIRV用于评估测序质量，并对实验结果进行分类。据此，可验证RNA的测序流程，并找出测序偏差和盲点。另外，通过质控数据与数据库进行比对，确定实验间的一致性，使差异表达分析更加准确。

设计
模块化概念
Spike-In RNA对照质控品有两个模块，即isoform模块和ERCC模块，每个模块用于特定的研究场景。

Isoform 模块
SIRV isoform模块以“集合浓缩”方式模拟转录组的复杂性（Fig. 2），它包括来自7个人类模型基因的69个人工可变剪切转录本组成。该模块全面反映了可变剪接、可变转录起始和终止位点、重叠基因和反义转录的变化。每个模型基因有6到18个可变转录本，isoform的复杂性非常高，可以对RNASeq工作流程进行深入的探测1。为不同转录本的注释流程提供了正确的以及(示例性的)不充分和过度的注释2。SIRV isoform模块有三种，Mix E0 (所有的SIRV 转录本等摩尔比例混合)，E1(不同转录本拷贝数之间差异可高达8倍)，E2（不同转录本拷贝数之间的差异可高达128倍）。

ERCC 模块
External RNA Controls Consortium (ERCC)，由92个人工转录本组成，且无重叠序列。由于其序列的独特性，在不考虑isoform的情况下，适用于技术参数的评估。ERCC Mix1覆盖220（106）的动态范围，可解决整个表达谱转录本丰度的复杂性问题3，4。将指定和评估的reads与已知浓度进行比较，可以评估动态范围、响应剂量、检测下限和工作流程的有效性。

Figure 2 | SIRV设计概览。 SIRV1到SIRV7，模拟人类模型基因，全面代表了主要的可变剪切方式以及大量的重复和差异转录。A)7个SIRV的isoform和92个ERCC基因可视为人工染色体，即SIRVome；B）SIRV3的放大图，提供11个转录本可变剪切体（绿色）；灰色区域的转录本可变剪切体是附加的注释，用于其他的评估流程；C）SIRV mix中转录本isoform浓度已知，对应预期的基因和外显子连接覆盖范围(蓝线为正链，红线为负链)。该预期范围与实验获得的reads覆盖范围(绿色区域)进行比较。

SIRV-Sets
三套SIRV，每一套含有不同的SIRV Mix或者Mix组合，满足不用的用途（Tab. 1）。Table 1 | SIRV选择指南。SIRV-Set 1 (货号025.03) 包含 Isoform 模块的Mixes E0、E1和E2； SIRV-Set 2 (货号050.01 and 050.03) 仅含 IsoformMix E0；而SIRV-Set 3 (货号051.01和051.03) 包含SIRV Isoform Mix E0 和ERCCs.✔: 代表可用, : 代表不可用，部分可用（部分Set可用）

SIRV-Set 1
SIRV-Set 1含有3种不同的“isoform模块”：E0、 E1和E2，每种混合物含有所有69种SIRV isoform转录本(来自7个SIRV基因)，但浓度比例不同(Fig. 3)。 在特定的RNA测序工作流程下，E0是评估isoform检测能力的理想选择，因为所有69种转录本都以等摩尔浓度存在，它们不作为测序深度的评估选择。E1中包含中等浓度的给定基因的各种转录本；E2代表了一种自然的状态，1个基因的一种转录本占主要丰度(转录本可达17种isoform)，其他低表达量的转录本小于1%。E2不仅可以校正短读长的转录本检测，而且还可以对长读长或者限制读长的测序平台进行线性和灵敏度评测。

Figure 3 | 三种isoform Mix中4种SubMixs的分布，以及3种isoformMix按照不同组合混合后的4种SubMixes在混合物内及混合物间的比率变化。每个SIRV转录本作为Sub Mix的一部分进行混合，并且7个SIRV基因中的每一个isoform转录本分布在所有Sub Mix上。左图：Mix内浓度有三种不同的浓度设置，以评估相对浓度测定的准确性。右图：预设的倍数变化提供3种可能的不同组合混合物间比较，以评估基因差异表达的测定。

SIRV-Set 2
SIRV-Set 2:等摩尔isoform Mix E0。它非常适合于成本敏感的应用和RNA-Seq实验，这些实验只需对复杂的isoform混合物进行检测，而不需要很深的测序深度来覆盖不同浓度转录本。SIRV-Set 2非常适用于一致性的计算，因为实验的指纹图谱仅依赖于SIRV isoform的复杂性而非浓度差异。

SIRV-Set 3
该组包含Mix E0和ERCC Mix，二者各占50%。69个SIRV isoform转录本和92个无重叠的ERCC RNA的混合物满足了参入（Spike-in）RNA质控品的复杂性需求，可兼顾isof orm的高度复杂性和宽浓度范围的试验特性。可对整个RNA测序工作流程进行更全面的质量评估和监测，并获得技术细节以及用于比较独立样本和实验间的指纹图谱。单一的isoform ERCC转录本覆盖6个数量级的浓度，辅以等摩尔浓度的SIRV isoform（Fig. 4）。

Figure 4 ǀ SIRV-set3中的转录本浓度和复杂性。此isoform模块，每个基因具有多达18个转录本，所有的RNA摩尔浓度均相同(绿色条)。单一isoform ERCC模块涵盖6个数量级（灰色条）的浓度，其反映了天然存在的转录本的整个动态范围。Attomole量是指混入100ng总RNA的量。

数据分析
将spike-in RNA-seq实验的数据统一比对到参考基因组以及SIRVome (人工“基因组”涵盖标准品的详细序列和注释信息)上。常规和定制的生物信息学工具可从不同维度对检测的结果和预期的SIRV reads分布进行比较，如从原始reads的比对到转录本鉴定及定量。

在“Galaxy”环境中使用已经发表的软件工具以及算法，能够在免费的“SIRV Suite”中实现示例性数据评估的工作流程(www.sirvsuite.org)。它可以为单个SIRV实验以及实验间的比较提供设计和评估。为了评估RNA测序中的ERCC测序数据，NIST提供了名为“ERCC dashboard”5的软件包，并且在SEQC/MAQC-III协会的出版物中对其做了进一步的评估6。

数据分析的质量测定包括准确度和精度以及偏差系数(CoD)，衡量实测和预期之间的偏差(参见Fig. 2)。虽然在方法开发过程中监控绝对排序非常重要，但实验数据比较的关键参数不是实验中偏差的程度，而是偏差的一致性。可以基于SIRV的复杂性来确定实验之间的偏差。这些分析的结论有助于判断数据之间是否具有可比性，并且有助于设置实验固有偏差的基线，了解样本之间的技术差异是提出有意义的生物学问题的先决条件。

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