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转录组测序 转录组广义上指某个物种或特定细胞在某一生理条件下产生的所有的RNA，包括mRNA、核糖体RNA、转运RNA及非编码RNA等，狭义上指所有mRNA的集合。转录组是研究细胞表型和功能的重要手段。与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空间的限定。同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的。转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。相对于传统的基因芯片技术而言，转录组测序无需预先设计探针，即可对任意物种的任意细胞类型的转录组进行检测；能够提供更精确的数字化信号，更高的检测通量以及更广泛的检测范围，是目前深入研究转录组复杂性的强大工具，目前已广泛应用于各物种的基础研究、临床诊断和药物研发等领域。 建库测序流程 进行转录组测序,提取样品总RNA并使用DNase消化DNA后，用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA（若为原核生物，则通过试剂盒去除rRNA来富集mRNA）；加入打断试剂将 mRNA打断成短片段，以打断后的mRNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链成反应体系合成二链cDNA，并使用试剂盒纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer质检合格后，使用Illumina HiSeqTM 2500或 Illumina HiSeq X Ten等测序仪进行测序，产生125bp或150bp的的双端数据。质检合格后，使用Illumina测序仪进行测序。 建库测序流程图如下：
生物信息分析流程
样品要求 真核 RNA样品总量: ≥1.5μg 样品纯度：OD260/280=1.80-2.00，RIN≥7.0 28S/18S≥1.0 原核 RNA样品总量: ≥1.5μg 样品纯度：OD260/280=1.80-2.00，RIN≥7.0 23S/16S≥1.0 常见问题 1. 转录组测序是否可以同时检测mRNA、miRNA及其他非编码RNA？ Q20：原始数据中Phred数值大于20的碱基数量占总碱基数量的百分比。 Q30：原始数据中Phred数值大于30的碱基数量占总碱基数量的百分比。 4. 原核生物与真核生物在进行转录组测序文库构建时有什么区别？ 在原核生物中，mRNA 只占全部 RNA 的 1-5%，其余绝大部分是核糖体 RNA（rRNA），因此若要测序 mRNA，首先需要先将 mRNA 纯化出来。然而，原核生物并不像真核生物 mRNA 具有 polyA 的结构，因此，无法直接利用 oligo(dT) 将 5. 关于转录组 De novo 分析，采用什么软件进行拼接，使用的参数是什么？mRNA 纯化出来。如果拿 total RNA 进行测序，那么测序的效率会比较差，因为大部分的序列都来自 rRNA。目前，提高原核生物中 mRNA 的量，较为主要的方式是去除 total RNA 中 rRNA。 De novo 拼接是指在不依赖参考基因组的情况下，将有 overlap 的 reads 连接成一个更长的序列，经过不断的延伸，拼接成 transcript。我们使用 Trinity (version:trinityrnaseq_r20131110_ 软件 paired-end 的拼接方法，对样本的有效 reads 合并进行 de novo 拼接，取每个 Loci (comp*_c*_) 下较长的转录本作为 Unigene，以此作为后续分析的参考序列。参数为 6. Raw data 如何读取？为什么不提供原始图像数据和中间过程文件？：Trinity.pl --seqTypefq --min_contig_length 200 --JM 400G --left $R1 --right $R2 --SS_lib_type RF --output trinity_out_dir --CPU 80。 测序数据文件以 txt 文本格式为主。对于 Windows 用户，推荐使用 Editplus 或 UltraEdit 作为浏览程序，否则会因文件过大造成死机。Unix 或 Linux 系统比较适于浏览较大的文本文件。由于 Illumina 更新了 pipeline，测序过程中生成的图像文件将实时转化为中间过程文件，这一步完成后图像文件将被自动删除，获取中间过程文件（此文件为二进制文件，只有在 Illumina 机器上才能读取，通常不保留），在 Illumina 分析软件下将其转化为序列文件，即所说的 raw data 。目前各公共数据库接受 fastq 文件，所以我们提供的 raw data 都是 fastq 文件。 一、样本准备应该遵循的基本原则代表性原则取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此您应该根据实验目的慎重选择... 转录组标准版模块1、原始数据处理模块：原始数据质控原始数据统计SE数据质量剪切PE数据质量剪切 原始数据比对转... 软件特色权威度高功能全面分析模块均源于公开发表的文献中分析内容一网打尽简单易上手快速、高效零基础、无需命令行和编程... 做RNA-Seq的**步是提取RNA并质检，每当公司将RNA的质检报告交给你的时候，你是不是从来都是略过过程只看结... 1、界面简洁，轻松实现转录组数据管理，再多的转录组项目和样本也能轻松搞定！2、支持有参转录组分析、扩展支持无参转录... 数据文件配置说明安装数据文件，配置说明！1、下载database.zip文件，本地下载 百度网盘压缩包的目录结构为... 软件界面说明！软件界面的上方是菜单栏和工具栏，集合了一些常用的功能，如新建项目、保存项目、复制、粘贴、数据导入、数... Frequently Asked Question如何在项目编辑窗口中修改文件格式？1、在项目编辑窗口中，在文件名... 韦恩图，又称为venn图，是我们在日常数据处理过程中经常用到的一种图。图虽小，但实用性却非常高！做转录组项目，最重要的就是看每个基因的表达量，根据表达量差异找出差异基因，从而研究差异基因的功能。而在作图之前最重要的就是按照特定条件找出差异基因，此方面我们分为三类来介绍如何按需筛选差异基因：1.共有差异基因；2.共有上调基因或共有下调基因；3.一组上调，另一组下调基因。在转录组项目提供的结果中... 下面，咱们就来看看用EXCEL的函数，简单快捷的实现，将多个表格里面，相同的基因ID对应的信息整理在一起。1首先通过差异倍数或者GO和KEGG的富集分析结果，挑选出一些目的基因，示例如下：2添加表达量信息，打开expression表格，总表中是所有基因的reads count和FPKM，我们将FPKM添加到目的基因表格中:3在1中的表格的B列，输入=VLOOKUP(可以将不同表格对应起来的值... |
