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焦磷酸(Qiagen Q96)测序(DNA甲基化,SNP)
技术简介
样本要求
研究方案
技术支持
报告模板
技术简介

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术服务基于QIAGEN公司的PyroMark Q96 ID平台,能提供基于序列测定的SNP检测、等位基因频率分析和甲基化检测,杂合子缺失及细菌和病毒分型等技术服务。


焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术的原理:

首先通过PCR制备待测序的DNA模板,PCR的引物之一是用生物素标记的。PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育,DNA双链经碱变性分开;纯化得到含生物素标记引物的待测序单链,并和测序引物结合成杂交体。 Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应,四种酶是:DNA聚合酶(DNA polymerase)、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。 测序反应是这样进行的:在每一轮测序反应中,只能加入四种dNTP(dATP S,dTTP,dCTP,dGTP)之一,如该dNTP与模扳配对,聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团(PPi)。掺入的 dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.注意:反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATP S)是dATP的替代物,因为DNA聚合酶对dATP S的催化效率比对dATP的催化效率高,且dATP S不是荧光素酶的底物。 硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP,ATP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由pyrogram™反应为峰。每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系。然后就可以加入下一种dNTP。 随着以上过程的循环进行,互补DNA链合成,DNA序列由Pyrogram的信号峰确定。


项目流程:
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样本要求

样品要求

· 样品类型

细胞、新鲜组织或DNA样品

· 样品量

细胞样品请提供至少1×106个细胞,组织样品请提供至少100mg的组织块或切片,DNA样品请提供1 μg以上的DNA

· 样品质量

基因组DNA无明显降解,主带清晰,大于23Kb,无明显弥散。OD260/280值在1.8~2.0之间,浓度 ≥ 50ng/μl

· 样品保存

细胞样品或新鲜组织块(切成~50mg的小块)可液氮冻存后,-80℃保存。DNA样品可溶于乙醇或超纯水中,-80℃保存。样品保存期间避免反复冻融

· 样品运输

样品置于1.5 ml冻存管中,封口膜封好,干冰运输

研究方案
系统用途:
多用途遗传分析系统,可应用于各种遗传多态性标记的分析检测,如SNP、突变、插入/缺失、甲基化、基因拷贝数等;等位频率分析;此外,还可应用于各种微生物的鉴定、分型、耐药性评估,并可对多种亚型或野生株及突变株、耐药株组成的复杂群体中的各个组分含量直接加以定量评估。
服务项目:
1.SNP分型检测

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优势:
  • ◇ 单一位点的质量评估和序列信息

  • ◇ 分析含有CpG位点的SNP

  • ◇ 序列信息中不同位点的频率计算

  • ◇ 适用于新鲜冷冻,和石蜡包埋的样本

  • ◇ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现

  • ◇ PCR反应之后,1个小时内可同时平行分析96个样本

2.甲基化检测服务
基本流程 在表观遗传学的DNA甲基化研究中,新一代的测序方法可得到大量的全基因组甲基化特征数据,需要验证其中特定靶序列与表观遗传修饰的生理相关性。此验证过程较具挑战性,因为甲基化位点的位置和频率的微小改变也会带来明显的变化。焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点,是理想的验证方法。因此该技术在表观遗传学研究中逐渐成为数据分析的金标准。 设计甲基化分析反应体系往往十分复杂,因为在非CpG位点胞嘧啶转化为胸腺嘧啶会影响引物的结合。为了解决这个问题,QIAGEN最近研发出了针对特定基因的预设计PyroMark CpG Assays,可覆盖整个人类基因组。这些试剂盒可用于CpG甲基化分析,并扩展了靶序列和CpG岛的选择范围。

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优势:
  • ◇ Pyrosequencing 能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平,甚至包括测序的引物区域

  • ◇ 启动子序列中接近的不同CpG岛的甲基化频率计算

  • ◇ 适用于新鲜冷冻,和石蜡包埋的样本

  • ◇ 不同的应用实验可同时在一次运行中实现

  • ◇ PCR反应之后,1个小时内可同时平行分析96个样本

技术支持

检测原理




引物设计



结果展示


报告模板

1 材料

1.1试剂与试剂盒

1.2仪器

2方法

2.1DNA抽提

2.1甲基化修饰

2.2 纯化亚硫酸盐修饰的DNA

2.3 甲基化PCR

2.4 Pyrosequencing检测