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当前位置
DNA甲基化测序

DNA甲基化修饰类型

  • 5mc是表观遗传最重要的一种修饰,广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中,被誉为“第五碱基”;

  • 5hmc是最新发现的一种修饰碱基,成为哺乳动物的“第六碱基”;

  • 6mA在细菌、藻类及动植物基因组中存在。

    甲基化5mc检测的金标准——Bisulfite Sequencing

    1992年,Frommer et al.将重亚硫酸盐处理结合测序进行DNA甲基化检测。从此,Bisulfite Sequencing(BS)成为金标准方案。其特点是:

  • 单碱基分辨率;

  • 结合测序。


WGBS
RRBS
TBS
6mA
MeDIP
hMeDIP
5hmC Seal
Whole genome bisulfite sequencing, WGBS

项目介绍:

WGBS甲基化检测最有力的方案

全基因组甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing, WGBS)

是结合重亚硫酸盐Bisulfite处理和NGS高通量测序技术,

对有参考基因组的物种在全基因组水平进行单碱基分辨率的甲基化检测,

适合各种类型的样本(细胞、全血、组织、病理切片、血浆cfDNA)

广泛用于人、动物及农林牧渔等方向的高水平甲基化研究。

用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

已经完成人、动植物等几十个物种, 5000+例样本WGBS项目经验;

已完成常规样本、复杂样本(FFPE)及微量样本(血浆cfDNA)多种样本类型项目;

严格WGBS建库质控和效率,Bisulfite转化率>99%;

自动化建库测序流程,保障WGBS周期交付能力;

核心团队发表Genome BiolNat CommunCell Res等高水平SCI文章;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果


样本类型和要求

   

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 3ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

血浆/血清/cfDNA

建议提供1-4ml血浆/血清, 或者>15ng cfDNA

细胞、全血、动植物组织等

按照送样要求准备

备注:用封口膜密封样品; 干冰运输


信息分析

WGBS

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

比对率和覆盖度分析

3、甲基化位点Calling

评估胞嘧啶甲基化状态

4、甲基化分布图谱分析

甲基化在基因组、功能元件上的分布

5、组间差异甲基化DMR分析

寻找DMR及注释

6、差异甲基化基因DMG分析

DMG富集分析GOKEGG

7、多样本聚类分析

PCA分析多样本甲基化变化规律

高级分析

8、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

9、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘


常见问题:

Q1:哪些物种可以研究WGBS?

具有参考基因组的人、模式生物、其它动植物、藻类、真核生物等;至少拼接到scaffold水平, 具有较为完整的注释。

Q2:WGBS主要的技术质控?

一般通过加入没有甲基化化修饰的lambda DNA质控Bisulfite的转化率,要求转化率>99%.

Q3:WGBS具有哪些优势?

WGBS的优势主要是体现在技术层面上:

1、不仅能够高精度发现CpG岛等常见区域的甲基化水平的变化,还能够分析gene body区,基因间区等区域的甲基化水平的差异,因此,技术上WGBS是研究甲基化最有力的方案;

2、适用于动植物所有有参基因组物种及几乎所有样本类型,例如细胞、全血、新鲜冷冻组织、病理FFPE、cfDNA等临床样本等;

Q4:WGBS具有哪些劣势?

WGBS的劣势主要是体现在应用层面上——成本最高!

由于WGBS推荐测序深度>30X基因组,成本与基因组大小成正比, 因此在不同的应用领域,主要是考虑成本费用因素:

1、对于小基因组物种, 例如大豆、水稻等油粮作物、绝大多数蔬菜水果等植物物种(基因组大小<1.5G), WGBS是非常合适也是**的金标准检测方案; 应用上,广泛用于经济植物遗传育种、生理病理机制研究等;

2、对于人和哺乳动物大基因组样本(基因组大小在2-3G),WGBS的测序成本非常高,制约了其应用;同时除了WGBS方案,人和动物样本还可以选择最高性价比的RRBS方案及甲基化芯片(例如850K芯片,**于人样本):

在临床样本甲基化研究中,由于临床样本异质性较大,课题设计需要检测的样本数量要求较多,一般10-30个样本/分组,WGBS检测成本大大制约了其在临床科研中的应用;

在大型队列研究中,虽然WGBS是终级方案,但也受制于陈本制约,很难检测较多样本;

在模式动物机制研究中,一般3-5个样本/分组,由于课题设计需要检测的样本数量较少,整个课题成本相对可以接受。

如下图所示,WGBS应用方向及推荐指数:


除了成本制约因素,临床样本检测需要更为准确的甲基化检测方案

甲基化检测的准确性由测序深度决定的,依次为RRBS > WGBS > 850K芯片。

WGBS:类似突变检测的WGS(重测序),由于WGBS比对率较低和文库冗余比例较高,实际覆盖基因组范围在70%左右,有效覆盖深度为15-20X

RRBS:是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案,检测单碱基分辨率的高CG区域,仅需少量的DNA样本和较低的成本而被广泛使用。RRBS类似突变检测的WES(全外显子测序),有效测序深度达到50-100X,比WGBS高出很多,因此甲基化检测准确性更高;

850K芯片:基于甲基化分析平台MethylationEPIC 850K BeadChip, 采用Oligo nucleotide杂交技术,芯片的批次效应(batch effect)有时会较严重,信噪比较差(来自徐瑞华主编的《肿瘤学》第五版p73-74)850K芯片的准确性最低,覆盖基因组CpG位点最少,但是快速便宜,因此在早期EWAS甲基化研究中是非常不错的选择; 但随着WGBS和RRBS测序成本下降,甲基化850K芯片的应用越来越少。

应用案例:

案例分析1: 灵长类早期着床前胚胎发育DNA甲基化重编程(团队成员发表)

De novo DNA methylation during monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Research. 2017;27:526-539.

一、研究方案:灵长类胚胎发生的关键表观遗传调控需要DNA甲基化重编程,我们首先建立了基于转座酶的超微量WGBS测序技术,详细研究了猕猴早期着床前胚胎7个阶段(Sperm、Oocytes、Zygotes、2-cell、8-cell、Morula和ICM)的DNA甲基化动态变化过程。

二、研究结果:首次全面阐明了DNA甲基化动力学的“盈与亏”阶段特征,并通过DNA甲基转移酶功能缺失实验表明DNA甲基化影响早期猴胚胎发育。

案例分析2:大豆驯化和改良过程中的DNA甲基化足迹

DNA methylation footprints during soybean domestication and improvement. Genome Biol. 2018; 10;19(1):128

研究方案:本课题通过WGBS技术比较了野生大豆、地方品种和改良品种(n=45)在大豆驯化与改良过程中DNA甲基化的变化。

研究结果:鉴定了5412个甲基化差异区域(DMR), 而这些DMR基因富集在碳水化合物代谢途径。这为大豆不同品种间DNA甲基化提供了有价值的图谱,拓展了大豆驯化与改良的认识。

案例分析3:血浆DNA甲基化分析提示EBV病毒相关疾病的病因

Methylation analysis of plasma DNA informs etiologies of Epstein-Barr virus-associated diseases. Nat Commun. 2019;10(1):3256.

一、研究方案:本研究通过对鼻咽癌(NPC, n=15)、EBV相关性淋巴瘤(n=9)和传染性单核细胞增多症患者(n=5)的血浆游离DNA进行WGBS测序分析。

二、研究结果:发现EBV DNA甲基化图谱呈现疾病相关模式。这表明在鼻咽癌诊断中进行血浆EBV DNA甲基化分析具有重要的潜力。

Improved Reduce Representation Bisulfite Sequencin

项目介绍:

RRBS最高性价比甲基化检测方案

简化甲基化测序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS),

通过酶切富集启动子及CpG 岛区域,并进行Bisulfite 测序;

作为最高性价比的甲基化研究方法,RRBS在大规模临床样本的研究中具有广泛的应用;

在经典RRBS基础上,在国内首家推出强化版 RRBS,助力全基因组甲基化测序,

可覆盖全基因组范围内超过6-9M个CpG 位点,>90%数量的CpG岛及>85%数量的基因启动子。

核心技术质控,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

最早开发RRBS技术团队之一, 国内首家推出强化版RRBS服务;

已经完成人、哺乳动物及鱼类等多个物种, 10000+例样本项目经验;

严格的RRBS技术质控,MSPI酶切率>95%, Bisulfite转化率>99%;

自动化样本处理、建库及分析流程,保障高效周期,40天极速交付;

低至10ng建库,满足穿刺、流式分选、微切等微量珍贵样本的研究;

核心团队在Nature、Epigenetics、DNA Res等杂志发表多篇SCI论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。


样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 1ug; 浓度≥ 30ng/ul; 完整性好; 基于Qubit定量

细胞、全血、动物新鲜冷冻组织

按照送样要求准备

备注1:不推荐FFPE、cfDNA等片段化样本类型;

备注2:不适合植物物种;

备注2用封口膜密封样品; 干冰运输


数据分析

RRBS

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

比对率和覆盖度分析

3、MSPI酶切及Bisulfite转化率质控

MSPI酶切效率>95%; Bisulfite转化率>99%

4、甲基化位点Calling

评估胞嘧啶甲基化状态

5、甲基化分布图谱分析

甲基化在基因组、功能元件上的分布

6、组间差异甲基化DMR分析

寻找DMR及注释

7、差异甲基化基因DMG分析

DMG富集分析GO,KEGG

8、多样本聚类分析

PCA分析多样本甲基化变化规律

高级分析

9、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

10、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘


常见问题:

Q1:为什么RRBS是人和哺乳动物全基因组甲基化研究的首选方案?

RRBS MspI 酶切将CpG 位点富集出来进行测序,人和哺乳动物基因组DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上;因此,RRBS是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案,检测单碱基分辨率的高CG区域,仅需少量的DNA样本和较低的成本而被广泛使用。目前RRBS主要用于人、大小鼠、猴、猪、牛等哺乳动物,也常用于其他动物、鸟类及鱼类等物种。

下图是经典的人和哺乳动物基因组甲基化特征:

1、具有CpG岛的基因启动子区域,通常处于低甲基化状态,基因间区、重复序列等非冗余区域,通常处于高甲基化状态。

2CpG岛常位于基因转录调控区附近(启动子和**外显子区域), 60%的基因组编码基因相关;

3、人类基因组有约56MCpG位点,CpG岛约4.5万个, CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系。

Q2:为什么MSPI酶切率对于RRBS测序质控至关重要?

除了类似WGBSBisufite转化率>99%最基本的质控,RRBS还需要做好MSPI酶切富集的一致性等重要质控,而RRBS覆盖有效深度及重叠比例与MSPI酶切率密切相关;通常MSPI酶切率要求不低于95%,**能够达到99%如下图所示,通过严格的质控,目前可以至少保证不低于95%MSPI酶切率,以满足临床大样本及队列研究对甲基化测序技术高标准要求。


Q3:为什么推荐强化版RRBS测序,比经典RRBS的优势如何?

与经典RRBS比较,强化RRBS主要是增加测序量及酶切片段宽度,以便获得更多CpG位点甲基化信息;经典RRBS酶切片段偏小40-220bp,适用于早期的NGS测序read读度,一般为PE50/100,例如Hiseq2000等测序仪;而强化版RRBS提高酶切片段100-350bp,更适应目前主流测序平台PE150测序,可以获得更多的甲基化信息。

在国内率先开发和推广了强化版RRBS测序服务,其与经典RRBS的技术指标比较如下图所示:

Q4WGBSRRBS850K芯片在检测覆盖基因组范围和准确性上的选择?

人和哺乳动物DNA甲基化修饰发生在CpG位点上,人基因组包含约56MCpG位点, 集中分布在CpG岛、基因启动子、增强子等甲基化调控重要的基因元件上,同时散在分布在非CpG岛、基因间区、异染色质区域等。

技术上,WGBSRRBS850K在检测这些CpG位点的覆盖、偏向性和准确性有差异,如下表所示

WGBS:类似突变检测的WGS(重测序),由于WGBS比对率较低和文库冗余比例较高,实际覆盖基因组范围在70%左右,有效覆盖深度为15-20X

RRBS:类似突变检测的WES(全外显子测序),是研究基因组CpG甲基化性价比最高的方案,国内外甲基化测序服务商(Zymo Research及我们)相继推出强化版RRBS测序,可以显著增加基因组CG位点数量的覆盖,尤其在增强子、CGI shore等核心区域,强化版RRBS可以覆盖6-10M左右的CpG位点,占人基因组56MCpG位点的15%同时有效测序深度可达50-100X,比WGBS高出很多,因此甲基化检测准确性更高;

850K芯片:基于甲基化分析平台MethylationEPIC 850K BeadChip(450K芯片的增强版), 采用Oligo nucleotide杂交技术,芯片的批次效应(batch effect)有时会较严重,信噪比较差(来自徐瑞华主编的《肿瘤学》第五版p73-74)850K芯片覆盖的CpG位点主要在CpG岛、启动子及增强子等区域,设计覆盖0.85M左右的CpG位点,占人基因组56MCpG位点的1.5%左右;450K /850K芯片在早期人基因组甲基化研究中发挥了重要作用,其主要原因是WGBSRRBS在早期测序平台上的价格昂贵,无法满足临床样本全基因组甲基化研究。但随着WGBSRRBS测序成本下降,甲基化850K芯片的应用越来越少。

综上,从这3种技术检测基因组CpG覆盖范围, 依次为WGBS > RRBS > 850K芯片;甲基化检测准确性是由测序深度决定的, 依次为RRBS > WGBS > 850K芯片。

Q5WGBSRRBS850K芯片在不同甲基化研究课题中的推荐指数?

针对不同的甲基化研究课题需求,选择合适的技术方案!同时考虑技术的先进性、成本及研究的主要目的,对大型队列研究、临床样本()及细胞系模型等研究方向,不同的推荐,如下图所示:

应用案例:


案例分析1:DNA甲基化异常用于甲状腺结节诊断

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551

1、研究方案:恶性结节和良性结节常常难以诊断,本课题通过RRBS检测了109个甲状腺组织的DNA甲基化,发现癌旁、良性结节和癌组织之间存在显著差异,并在65个甲状腺结节的回顾性队列样本中得到验证。

2、研究结果:这些组织特异性DMR与活性增强子和癌症相关基因密切相关,表明DNA甲基化为甲状腺结节提供准确的诊断。并开发及验证了基于靶向甲基化测序TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位点甲状腺结节诊断的转化应用方案的重要价值。


案例分析2:癌前病变到浸润性肺腺癌DNA甲基组的演变

Evolution of DNA methylome from precancerous lesions to invasive lung adenocarcinomas. Nat Commun. 2021 Jan 29;12(1):687.

研究背景:在肺腺癌的早期癌变过程中,DNA甲基化谱和甲基化肿瘤内异质性(ITH)的演变尚未得到系统的研究。

研究方案:本课题通过RRBS方案对124个手术切除样本(14个非典型腺瘤性增生AAH; 15 个原位腺癌AIS; 22个微侵袭性腺癌MIA和11个侵袭性腺癌ADC及病灶旁样本)进行单碱基分辨率的甲基化测序。

研究结果:

1、在晚期病变中甲基化变异逐渐增加,甲基化水平明显升高;

2、从甲基化变异推断的系统发育模式类似于基于体细胞突变的模式,表明DNA甲基化和体细胞突变的演化是平行的;

3、在晚期疾病中T调节细胞(Tregs)与CD8+T细胞的比率较高,这意味着随着肿瘤进展免疫抑制;

4、此外,全局低甲基化增加与更高的突变负担、拷贝数变异负担和更高的Treg/CD8比率相关,表明DNA甲基化在肺腺癌早期癌变过程中对染色体不稳定性、突变和肿瘤免疫微环境的潜在影响。


案例分析3:产后发育过程中肠道菌群暴露驱动肠道上皮细胞的甲基化组及转录组变化

Exposure to the gut microbiota drives distinct methylome and transcriptome changes in intestinal epithelial cells during postnatal development. Genome Medicine. (2018) 10:27.

研究方案:肠道菌群在肠道发育中起重要作用,研究者收集1周、4周、12-16周龄(代表婴儿期、青少年期、成年期)的正常及无菌小鼠的小肠肠道上皮细胞(IEC),进行RRBS和RNA-seq测序,每组5个重复;

研究结果:研究发现细菌对转录组的影响随时间增加,而大多数菌群依赖性的DNA甲基化差异在出生后早期即出现,并鉴定出126个基因位点的DNA甲基化及RNA转录与菌群相关,通过靶向甲基化测序TBS (Deep Target Bisulfite Sequencing) 和RTqPCR在另外一组独立样本(10个/组)中加以验证。


案例分析4:发育基因的表观突变是养殖欧洲鲈鱼开始驯化的基础

Epimutations in developmental genes underlie the onset of domestication in farmed European sea bass. Mol Biol Evol. 2019 May 30.

研究方案:本研究通过RRBS测序,比较了早期驯化的(n=12)与野生的(n=12) 欧洲鲈鱼在驯化过程中DNA甲基化变化。

研究结果:发现早期驯化的鲈鱼与野生的没有遗传差异,但在不同胚胎起源的组织中发生DNA甲基化变化。这些甲基化突变与经过25年选择性育种后的胞嘧啶至胸腺嘧啶多态性显著重叠,表观突变基因与正选择基因一致。结果表明驯化初始阶的表观变异是一个重要事件。

Targeted Bisulfite Sequencing

项目介绍:


目标区域甲基化测序(Targeted Bisulfite Sequencing)

除了全基因组甲基化测序技术等研究手段,对于目标基因/CpG位点甲基化检测,需要灵活的靶向甲基化测序方案,

基于亚硫酸盐多重PCR捕获核心技术和NGS高深度测序的目标区域甲基化测序Targeted Bisulfite Sequencing,

满足几个到上百个基因/CpG位点的检测, 具有高准确性、高通量、低成本、快周期的优势,

广泛用于临床样本多位点的甲基化Biomarker筛选、验证及临床转化应用。

技术优势

基于亚硫酸盐多重PCR扩增捕获测序;

高效灵活的目标区域甲基化检测方案;

NGS高深度测序,单碱基分辨率,绝对定量的;

适合几个到几百个区域/CpG位点同时检测;

适合广泛的样本类型:血液、组织、病理切片、灌洗液、粪便等;

低成本、快周期的,超高性价比优势;

核心技术,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

最早开发TBS技术团队之一, 国内首家推出靶向甲基化TBS定制化服务;

已经完成血液、组织、病理切片、粪便等多种类型,10000+例样本TBS项目经验;

核心团队在Genome biologyDNA Res等杂志发表多篇SCI论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。


样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 200ng; 浓度≥ 10ng/ul; 基于Qubit定量

细胞、血液、新鲜冷冻组织等

按照送样要求准备

备注用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

TBS

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与目标区域序列比对

统计覆盖度分析

3、CpG位点甲基化水平统计

评估胞嘧啶甲基化状态

4、不同样本间甲基化水平比较

统计甲基化差异

高级分析

5、临床病理信息分析

甲基化与临床信息关联分析


应用案例:


案例分析1DNA甲基化异常用于甲状腺结节诊断

Identification of Tissue-Specific DNA Methylation Signatures for Thyroid Nodule Diagnostics. Clin Cancer Res. 2019;15;25(2):544-551.

本课题通过RRBS检测了109个甲状腺组织的DNA甲基化,发现癌旁、良性结节和癌组织之间存在显著差异,并在65个甲状腺结节的回顾性队列样本中得到验证。这些组织特异性DMR与活性增强子和癌症相关基因密切相关,表明DNA甲基化为甲状腺结节提供准确的诊断。并开发及验证了基于靶向甲基化测序TBS (Target Bisulfite Sequencing) 用于甲基化多位点甲状腺结节诊断的转化应用方案的重要价值。


案例分析2:血清游离DNA甲基化biomarker用于乳腺癌转移早期筛查

Methylation patterns in serum DNA for early identification of disseminated breast cancer. Genome Med. 2017;22;9(1):115.

本课题通过RRBS检测了31个样本,其中癌组织(n=8)和白细胞(n=23)的DNA甲基化,筛选出18个癌症特异的DMR, 进一步通过TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 在两个样本库(>1000例)的血浆cfDNA中验证,找到血清EFC#93用于早期识别弥散性乳腺癌的biomarker.


案例分析3:循环肿瘤DNA甲基化biomarker用于肝癌诊断和预后

Circulating tumour DNA methylation markers for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma. Nat Mater. 2017;16(11):1155-1161.

本课题通过TCGA数据库筛选401个甲基化Biomarker, 在1933例血浆中进行基于靶向亚硫酸盐测序(Targeted Bisulfite Sequncing, TBS) ,通过与临床样本信息进行关联分析,最终筛选了10个HCC诊断和8个HCC预后预测的甲基化Biomarker.


案例分析4:乳腺癌中48个基因甲基化普研究

Methylation profiling of 48 candidate genes in tumor and matched normal tissues from breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat. 2015;149(3):767-79.

PubMed文献检索与癌症相关的48个基因,180例乳腺癌患者配对的癌和癌旁组织样本库中,通过TBS (Targeted Bisulfite Sequencing) 检测这48个基因的启动子甲基化,寻找有价值的甲基化标记物;结果聚类分析筛选出13个基因(CST6、DBC1、EGFR、GREM1、GSTP1、IGFBP3、PDGFRB、PPM1E、SFRP1、SFRP2、Sox17、TNFRSF10D和WRN)为候选生物标志物,构建乳腺癌高效率的癌症预测模型。


案例分析5:靶向亚硫酸盐测序发现食管鳞癌甲基化biomarker

Targeted bisulfite sequencing identified a panel of DNA methylation-based biomarkers for esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).Clin Epigenetics. 2017. 15;9:129

基于TCGA数据库(450K芯片)等数据,**步筛选了5个潜在甲基化biomarker,第二步通过TBS (Target Bisulfite sequencing) 在94对ESCC样本中验证和评估,由5个CpG位点Panel的诊断模型具有很好的指标(sensitivity=0.75, specificity=0.88, AUC=0.85)

6mA免疫沉淀测序(6mA-IP Seq)

项目介绍:

DNA 6mA免疫沉淀测序(6mA-IP Seq)

N6-甲基脱氧腺苷(6mA)是原核生物和真核生物的DNA修饰类型之一,

在细菌、藻类及植物基因组中广泛存在,在DNA错配修复、染色体分离和毒力调节中发挥作用。

6mA免疫沉淀测序(6mA-IP Seq)通过特异性抗体富集6mA甲基化的DNA片段,结合NGS测序技术在全基因组水平上分析6mA修饰信息。

用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

国内较早开发6mA-seq技术团队之一, 严格的内参质控;

已经完成藻类及动植物及人等多个物种6mA-seq项目经验;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。

样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 5ug; 浓度≥ 50ng/ul; 基于Qubit定量

动植物、藻类、低等生物等

按照送样要求准备

备注:用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

6mA-IP Seq

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

测序Reads 在基因组上的分布

3、6mAPeak峰Calling

6mADNA富集区域鉴定

4、6mAPeak图谱分析

6mAPeak在基因组,染色体,功能元件上的分布

6、组间差异6mAPeak分析

寻找6mADMR及注释

7、差异6mAPeak基因分析

相关基因GO,KEGG富集分析

高级分析

8、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

9、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘


应用案例:


案例分析:衣藻基因组6mA甲基化谱研究

N6-Methyldeoxyadenosine Marks Active Transcription Start Sites in Chlamydomonas.Cell. 2015;7;161(4):879-892.

一、研究背景

N6-甲基脱氧腺苷(6mA)是原核生物和真核生物的DNA修饰类型。6mA在细菌中广泛存在,在DNA错配修复、染色体分离和毒力调节中发挥作用。相比之下,6mA在真核生物中的分布和功能还不清楚。

二、方法流程

取材:单衣藻(Chlamydomonas)

测序:6mA免疫沉淀测序(6mA-IP Seq)

验证:UHPLC-MS/MS: 整体6mA水平

三、研究结果

1、对衣原体基因组中的6mA进行了全面的分析,在84%的基因中鉴定出6mA修饰;

2、6mA主要位于转录起始位点(TSS)附近的AT二核苷酸上,具有双峰分布,并显示出激活基因的标记;

3、在6mA分布存在周期性模式, 与TSS附近的核小体分布有关,表明在核小体位置上可能起到作用。

四、研究结论

6mA的全基因组图谱及其在衣藻基因组中的独特分布表明6mA在真核生物基因表达中的潜在调控作用

羟甲基化免疫共沉淀测序(hMeDIP)

项目介绍:

甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-seq)

甲基化DNA免疫沉淀测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,MeDIP-Seq),

采用甲基化DNA免疫共沉淀技术,通过5'-甲基胞嘧啶(5mC)抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段测序,

可以在全基因组水平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究,

是分析基因组DNA甲基化变化的一种准确可靠的技术。

用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA甲基化完整解决方案;

最早开发MeDIP-seq技术团队之一, 严格的内参质控;

已经完成人、小鼠、大鼠、猪等多个物种MeDIP-seq项目经验;

核心团队在Nature communications, Genome biology等杂志发表多篇SCI论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果

样本类型和要求

样本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 3ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

细胞、全血、动植物组织等

按照送样要求准备

备注:用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

MeDIP

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量

2、与参考基因组比对

测序Reads 在基因组上的分布

3、Peak峰Calling

甲基化DNA富集区域鉴定

4、Peak图谱分析

Peak在基因组,染色体,功能元件上的分布

6、组间差异Peak分析

寻找DMR及注释

7、差异Peak基因分析

相关基因GO,KEGG富集分析

高级分析

8、多组学整合关联分析

例如与转录组关联分析

9、其它定制化分析

结合课题背景亮点挖掘



应用案例:


案例分析:同卵双胞胎2型糖尿病易感基因的表观基因组关联分析(团队成员发表)

An integrated epigenomic analysis for type 2 diabetes susceptibility loci in monozygotic twins. Nature communications. 2014; 5: 5719.

一、研究背景

2型糖尿病(T2D)是一种高度异质性疾病,通过遗传易感性和环境的结合引起。全基因组关联研究(GWAS)已经鉴定出至少65个T2D位点,但这仅解释了T2D疾病易感性的6%。T2D的变异也可能部分通过表观遗传效应来解释,比如DNA甲基化。

二、方法流程

取材:27对同卵双胞胎的全血:T2D-discordant (n=17), T2D-concordant (n=3), 对照组non-T2D group (n=7)

测序:甲基化DNA免疫沉淀测序(MeDIP-Seq)

验证:450K芯片:差异甲基化基因

三、研究结果

1、在这项研究中,对27对同卵双胞胎的全血DNA进行了MeDIP-Seq,发现了大量的与2型糖尿病相关基因的差异甲基化区域(DMR),并在随后的另外一批大量样本(42个T2D和221正常对照)的研究中得到了进一步的验证;

2、其中MALT1基因启动子区的甲基化变化,与血液中牛磺胆酸水平的变化直接相关,并涉及到胰岛素和血糖代谢相关的信号通路;

3、DNA甲基化组与T2D相关临床数据的分析结果表明了差异DNA甲基化区域在T2D易感性基因上的相对富集。

四、研究结论

总之,综合基因组学和表观基因组学的方法,加上同卵双胎的病理模型,我们很好地解释T2D等其他复杂性状疾病的致病原因,并发现潜在的药物靶标和生物标记物。




羟甲基化免疫共沉淀测序(hMeDIP)

项目介绍:

羟甲基化免疫共沉淀测序(hMeDIP-seq)

羟甲基化DNA免疫沉淀测序(Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,hMeDIP-Seq),

是通过5hmC特异性抗体富集羟甲基化的DNA片段,结合NGS测序技术在全基因组水平上以较小的数据量,快速、高效地寻找羟甲基化区域;

可广泛应用于羟甲基化与疾病关系研究以及羟甲基化在胚胎发育过程中的研究。

核心技术及质控,用心服务每一个项目

专注表观组学10年,提供专业有价值的DNA羟甲基化完整解决方案;

较早开发羟甲基化测序技术的团队,提供羟甲基化多种解决方案;

已完成人、小鼠、猕猴等多种物种的hMeDIP-seq项目经验;

助力客户在Clin Epigenetics等杂志发表多篇论文;

专业的生物信息分析团队, 提供更多个性化分析思路和方案。

科学方案设计

从项目方案、样本处理、建库测序,到数据分析;

每个项目需要专业、有价值的建议;及时高效的沟通,以保障高质量研究成果。


样本类型和要求

本类型

样本要求

基因组DNA

总量≥ 3ug; 浓度≥ 30ng/ul; 基于Qubit定量

细胞、全血、动物组织等

按照送样要求准备

备注:用封口膜密封样品; 干冰运输

数据分析

hMeDIP-seq

分析内容

备注

标准分析

1、测序数据质量评估

过滤掉低质量数据,保证数据质量