一文了解DIA、TMT/iTRAQ、传统Label free区别在哪？

近几年，生物质谱技术可谓是日新月异。随之与其搭配的实验技术也层出不穷、五花八门（如图1）；对于初入蛋白质组学的研究学者来说，选择什么技术路线来实现自己的研究目的？如何设计实验方案傻傻搞不清楚，今天我们就来看一下“新晋网红”DIA与“老牌实力派”TMT/iTRAQ、label free各自有何神通之处？

图1 | 蛋白质组学技术汇总

顾名思义，就是不使用任何标记方法，直接对肽段进行质谱鉴定和定性定量分析。实验流程简单（图2），只需要对蛋白进行常规酶解和除盐步骤即可上机。定量方式分为两种：峰面积（Peak intensity）和峰计数（Spectral count），常用的是峰面积。不过，由于质谱采集时只选取topN的母离子进行二级碎裂和MS2检测，所以会丢失一些丰度较低的肽段信息，缺失值比较多。

图2 | label free流程图

就拿其中的一个来说：TMT全称是Tandem Mass Tag，是赛默飞公司的经典化学标记试剂，广泛用于差异表达蛋白质组分析研究中。该技术采用6重、10重或16重同位素标签，与肽段的氨基发生共价结合反应，可实现同时对6个/10个/16个不同样品中蛋白质的定性和定量分析。

如下图3所示，TMT试剂在结构上包括3个化学基团，分别是报告基团、平衡基团和反应基团。反应基团特异与肽段的氨基发生共价结合反应，将TMT试剂连接到肽段上。

图3 | TMT试剂分子结构

在一级图谱中，不同样品来源于同一个蛋白质的同一个肽段由于被连接上总质量相同的完整TMT试剂而表现为一个峰。但在碰撞室内，平衡基团会发生中性丢失，而报告基团则会产生相应的报告离子（图4）。这些报告离子的强度就代表了相应样品蛋白质/肽段的强度，实现了对6个/10个/16个不同样品的同时定量。

图4 | TMT标记原理

TMT标记技术稳定，重现性好，但是商业化的试剂盒价格昂贵，而且标记通道数有限，不适合大队列样本的研究。

数据非依赖采集（Data independent acquisition，DIA）是近年来备受瞩目的质谱采集技术之一，一度引领了定量蛋白质组学新发展。其实它也是非标记技术的一种，DIA相比于传统label free的**的优势在于高效测定复杂样品中相对低丰度的蛋白分子，极大地提高了定量分析的可信度。

DIA技术的原理是在质谱数据采集时，高速、循环的将每个采集窗口内的所有母离子及其碎裂后的子离子进行全扫描（图5），而非根据母离子信号强度筛选后进行二级碎片再扫描。

图5 | DIA质谱采集原理

DIA具有高通量、高分辨率、高可重现性、定量准确等优点，而且样本无需分级上机，极大的缩短了每个样品的检测时间，适合大样本量的蛋白质组研究。

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