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一株耐利奈唑和万古霉素的猪链球菌

猪链球菌(Streptococcus suis)被认为是重要的抗药性库(AMR),有助于AMR基因向主要的链球菌病原体传播。利奈唑胺和万古霉素是治疗多重耐药的革兰氏阳性细菌感染的最后手段。耐利奈唑酮和万古霉素(LVR)的革兰氏阳性菌可能对公共健康构成严重威胁。

合作客户最新研究中,作者提出了**个猪源的LVR链球菌。该分离株由optrA和vanG操纵子介导。optrA和vanG操纵子的遗传基础通过全基因组测序(WGS)进行表征,并使用斑马鱼感染模型评估其毒力。


本文研究结果“Characterization of a Linezolid- and Vancomycin-Resistant Streptococcus suis Isolate That Harbors optrA and vanG Operons”发表于《Frontiers in Microbiology》杂志,影响因子4.259。


研究从总共658头猪样本中收集了189例猪链球菌临床分离株,通过抗生素抗菌药敏试验和LVR机制筛选,对三株菌株进行全基因组二代+三代测序,获得基因组完成图序列。



1vanGoptrA阳性猪链球菌的分离

在从中国江苏省收集的189株猪链球菌中,有3株来自不同猪的猪链球菌vanG呈阳性,但对万古霉素表现出可变的表型。 YSJ17Farm YS)菌株对万古霉素不敏感(MIC 2 mg / L),而YSJ7Farm YS)和HCB4Farm HC)对万古霉素敏感(MIC 0.5 mg / L)。另一方面,189株菌株中有68株(35.98%)为optrA阳性,利奈唑胺的MIC值为0.2516 mg / L

值得注意的是,所有三个携带vanG的分离株均对利奈唑胺不敏感,并携带optrA基因(2)。由于到目前为止尚未鉴定出vanGoptrA阳性细菌,因此文章通过WGS进一步分析了这些猪链球菌。



2、猪链球菌基因组测序和系统发育分析

对三个分离株的全基因组测序分析表明,它们都被分配为多位点序列类型ST1071ANI分析表明,YSJ17HCB4YSJ7分别具有0.99980.9987的平均同一性,但与24型血清型BSB6相似(图)。

进一步的SNP分析显示HCB4YSJ7YSJ17分别只有1个和343cSNP。根据荚膜多糖合成位点,可以将分离物分类为新型的荚膜多糖基因座NCL1。为了分析携带vanGoptrA的三种NCL1分离株的进化,通过与GenBank的其他NCL1菌株和猪链球菌血清型2P1 / 705ZYH33血清型 9GZ0565)和血清型24BSB6)的代表性基因组进行比较,生成了基于cSNPs的系统发育树。系统发育树表明,YSJ17HCB4YSJ7与血清型24BSB6聚集在一起,并且与其他NCL1株更加不同(下图)。



3AMR分子机制和可移动性分析

BLAST搜索获得的AMR基因后发现存在optrAvanG以及氨基糖苷修饰酶基因aadE, sat4, apt, aphA3aac(6)-aph(2’’)

为了进一步表征包含这些AMR基因的移动遗传元件(MGE),对分离物YSJ17进行了完整测序,获得一个4,065 bp的小质粒pYSJ17YSJ17染色体的大小为2,551,120 bp,编码2489基因。通过比较11NCL1菌株和血清型2924代表性菌株来绘制ICE和原噬菌图。确定了一个ICEICESsuYSJ17)和四个前噬菌体8SsuYSJ17-1-4)。

为了测试携带vanGICESsuYSJ17和携带optrA的SsuYSJ17-3的可转移性,进行了猪链球菌YSJ17和受体猪链球菌P1 / 7RF之间的交配实验。但是,在超过三次独立尝试后,无法使用氟苯尼考和万古霉素获得转导结合体,供体和受体的比例分别约为108109 cfu



4携带vanGICESsuYSJ17的遗传特征

携带vanGICESsuYSJ17的长度为79,886 bp,编码89个预测的ORFICESsuYSJ17的序列分析表明,它是一个类似于ICESsuBSB6ICESsuHA681的镶嵌ICE,属于ICESa2603家族(A)。ICESsuYSJ17的大部分与ICESsuBSB6几乎相同,在后者的ICE中仅存在两个额外的IS元素IS1533IS1216下图A)。这包括包含erm(B),tet(O/W/32/O)和aadE-apt-sat4-aphA3簇的ARGI1,以及带有vanG操纵子。

由于猪链球菌YSJ17HCB4对万古霉素敏感,因此测试了vanG操纵子是否完整,以探索该表型的遗传基础。 在菌株YSJ17HCB4vanXY基因的365碱基的碱基处插入了1,503 bpIS元件,与ISSsu2具有97%的同一性。结果,尽管没有观察到vanURS调节操纵子的作用,但它消除了vanYWG(XY)T抗性操纵子的表达。

携带56,723-bpoptrA的SsuYSJ17-3整合到了rum基因的1328碱基处,该基因是其他MGE保守的插入热点。遗传比较表明,SsuYSJ17-3携带optrA NCL1菌株YS2/YS49/YS50的基因组序列共享保守的前噬菌体骨架(B)。值得注意的是,SsuYSJ17-3存在于当前10NCL1菌株中,但在其他猪链球菌血清型菌株中却不存在。

与粪肠球菌质粒和染色体中optrA的遗传背景不同,猪链球菌SsuYSJ17-3上存在6,568 bp大小的复合转座子IS1216E-araC-optrA-hp-catpC194-IS1216E结构。使用optrA-F2/catpC194-RoptrA-R2/catpC194-F进行PCR分别扩增了2857 bp3405 bp的产物(下图)。这证实了在所有三个分离物中都形成了大小为5759 bpIS1216E-araC-optrA-hp-catpC194 TU


5万古霉素耐药性菌株YSJ17的毒力测定

为了测试是否在YSJ7中诱导出对万古霉素的vanG型抗性,文章进行了万古霉素抗性表型和vanG转录测定。 正如预期的那样,与1/10×MIC万古霉素预孵育缩短了生长滞后(图),并且在存在1/10×1/2×MIC万古霉素的情况下,vanG转录分别增加了5.64.3倍。这些表明,猪链球菌YSJ17 vanG型对万古霉素具有抗性,并且vanG转录与肠球菌相似。

为了评估LVR菌株的毒力,首先在基因组中确定了24种与猪链球菌2型毒力有关的毒力相关基因的分布。在所有三个分离株中检测到16个毒力相关基因。

尽管经常从健康猪和患病猪的肺中分离出NCL1毒株,但尚未通过动物模型对其进行准确评估。为此,研究通过斑马鱼感染模型测量了YSJ17的毒力。注射剂量为106107 cfu72小时后,死亡率分别为086.67%(图)。而对于猪链球菌血清型2毒株SC070731,在剂量为106107 cfu时,死亡率分别为40%和100%。 YSJ17LD500.9×107 cfu /鱼,SC070731LD501.2×106 cfu /鱼。用无毒力菌株SH040917感染的斑马鱼没有死亡。这些结果表明,NCL1菌株YSJ17的毒力比猪链球菌血清型2的毒株SC070731低。但是,其致病机制有待进一步探讨。


总结


本文是关于革兰氏阳性细菌中同时optrAvanG操纵子研究的首次报道。 optrAvanG的猪链球菌的获得和持续存在有助于这些抗性基因向其他革兰氏阳性细菌的潜在转移。

【参考文献】


Characterization of a Linezolid- and Vancomycin-Resistant Streptococcus suis Isolate That

Harbors optrA and vanG Operons. Frontiers in Microbiology, 2019.