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项目简介
技术流程
样本要求
结题报告
FAQ
项目简介

  染色质是真核生物基因组DNA主要存在形式,对蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用的研究可以阐明真核生物基因表达调控机制。染色质免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitaion, ChIP)是用来研究细胞内特定基因组区域特定位点与结合蛋白相互作用的技术,可用于DNA与多种蛋白的互作研究。

       ChIP-Seq是指将ChIP与新一代测序技术相结合,可在全基因组范围内分析蛋白结合位点。用于在全基因组范围中研究DNA结合蛋白(相互反应)、组蛋白修饰(表观遗传标记)和核小体的技术,研究这三个主题可有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构。

       ChIP-Seq实验原理:在生理状态下,把细胞内的DNA与蛋白质交联(Crosslink)后裂解细胞,分离染色体,通过超声或酶处理将染色质随机切割,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来,再通过反交联(Reversecrosslink)释放结合蛋白的DNA片段,最后测序获得DNA片段的序列。

1.jpg

ChIP-seq实验原理

       ChIP-Seq研究应用:转录因子结合位点(transcription factor binding sitesTFBS)、组蛋白修饰(histone modification),并且可以对多个样品进行差异比较。组蛋白方面,研究人员可通过ChIP-Seq探究组蛋白的甲基化、乙酰化、泛素化修饰对其结合DNA的影响。在转录因子方面,可通过分析转录因子结合序列的特征发现其经典作用基序或协同作用因子,也可通过分析这些转录因子在基因组上的位置分布情况来拓展其基因调控作用。转录因子通常分布在基因启动子区和增强子区,通过ChIP-Seq检测特定转录因子分布情况,可能发现新的靶基因或调控机制。此外,通过比较转录因子在不同阶段或不同状态的样本中靶点的差异,还可分析该转录因子的作用差异。

       ChIP-seq提供了一种高分辨率、低噪音、高覆盖率的研究蛋白质-DNA互作手段,可应用到所有基因组序列已知的物种,可研究任何一种DNA相关蛋白与其靶定DNA之间的相互作用,并能确切得到每一个片段的序列信息。而ChIP-seqHiCATAC-seqRNA-seq的联合研究可以对基因转录调控作用进行详尽的分析。ChIP-seq正逐步成为研究基因调控和表观遗传机制的热点手段,具有很好的应用前景。

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ChIP-seq与其他技术的区别

       ChIP-Seq的优势:

       1、具有碱基层面的分辨率;

       2、不会有ChIP-chip中由DNA片段杂交导致的噪音;

       3ChIP-chip中的微阵列信号不是线性增长的,其所测量的范围有限。

       4、由于在设计array时,探针的数量、种类有限,当coverage比较高的时候无法准确测量,也无法发现新的序列。

  参考文献:

1.Zhang X L, Wu J, Wang J, et al. Integrative epigenomic analysis reveals unique epigenetic signatures involved in unipotency of mouse female germline stem cells[J]. Genome Biology, 2016, 17(1): 1.

2.EglN2 associates with the NRF1‐PGC1α complex and controls mitochondrial function in breast cancer. (EMBO J, 2016)

3.Conditional Knockin of Dnmt3a R878H inituates acute myeloid leukemia with mTOR pathway involvement  (PNAS, 2018)

4.FAR-RED ELONGATED HYPOCOTYL3 activates SEPALLATA2 but inhibits CLAVATA3 to regulate meristem determinacy and maintenance in Arabidopsis. (PNAs, 2016)

5.H2A monoubiquitination in Arabidopsis thaliana is generally independent of LHP1 and PRC2 activity. (Genome Biology, 2017)

6.SETDB1 modulates PRC2 activity at developmental genes independently of H3K9 trimethylation in mouse ES cells (Genome research, 2015,IF=11.3)

技术流程

技术流程

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项目周期

产品类型

策略

推荐数据量

周期

Chip-seq

Illumina  HiSeq2500 SE50若有特殊要求可选择PE125

组蛋白修饰:20M reads

非组蛋白修饰:≥10M reads

40



样本要求


产品类型

文库类型

送样要求

ChIP-seq

100-150bp的小片段文库

样品类型:ChIP富集的DNA样品(客户完成)

样品需求量:20ng;

样品浓度:1ng/ul;

样品体积:20ul;

OD260/280=1.8~2.0

DNA片段大小:分布在100-500bp范围,且主带明显,请提供DNA打断后的检测胶圈以确定DNA片段大小是否符合要求;请附加一份详细的样品信息单并提供ChIP后的q-PCR验证结果。


1样本要求

1.1 新鲜细胞样品
     
若客户送样为培养中的新鲜细胞,我们会对细胞进行细胞计数和蛋白质DNA的交联。对于进行转录因子(polIICTCF等除外)的ChIP实验,我们会分出部分细胞用于鉴定。具体要求为:

a.Histone ChIP细胞量>20millionTF ChIP细胞量>100million

b.客户样品、抗体、样品的完整信息单

c.新鲜细胞需要我公司进行细胞固定,请务必于送样前一天通知实验人员,准备时间进行细胞处理

1.2 已固定细胞
     
若客户自己进行细胞的固定,请务必严格按照销售提供的实验操作步骤进行。对于进行转录因子的ChIP实验,需要准备3份样本,其中2份是固定后的样本,用于ChIP实验,1份是未固定细胞,用于检测目标转录因子在细胞核里的表达量。具体送样要求为:

a.用于ChIP实验的细胞Histone细胞量每份>10millionTF细胞量每份>50million

b.ChIP-seq实验同一批次培养的未固定细胞沉淀2million(管内不应要有液体残留)

c.客户样品、抗体、样品的完整信息单

1.3 组织样品
      a.
所送动物组织质量应当>100mg,并且组织新鲜。

b.建议取材后用生理盐水进行漂洗,以去除血渍和污物,并剔除结缔组织等非研究组织。

c.将样品分割成100 mg左右的小块,样品分割和处理时应在冰上进行,防止样品降解。

d.为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。

e.客户样品、抗体、样品的完整信息单。

f.若需要长途运输,请将组织样品液氮速冻,干冰运输。

2、样本运输

2.1样品包装

样品包装.png

2.2 样本标识

在容器表面写清样品名称,且与信息单上一致。不建议用油性笔直接在管壁或管盖上写样品名称等信息,**将样品名称等各种信息写在标签纸上,贴在管壁,外面再用透明胶带缠绕一圈(防止标签纸没有粘牢脱落,导致样品无法应用)

2.3 样本运输条件

1、运输过程中需要添加的干冰和冰袋的量与季节、运输时间长短、泡沫盒的薄厚有关(为更有利于保温,尽量选用大块的干冰,建议将样品用透明胶固定于冰袋上,防止干冰挥发导致样品降解)

2、所有样品尽量保证48小时内运达。

3、销售请于寄送前告知实验室人员和科研助理,所有样品不支持到付。

结题报告

1 项目信息

1.1 基本思想

1.2 实验流程

1.3 信息分析流程

1.4 样品说明

2 数据过滤及比对

2.1 原始数据

2.2 数据过滤

2.3 数据质量值分布

2.4 数据碱基分布

2.4.png

R e a d s碱基比例分布图

2.5 比对分析

2.6 比对质量

2.6.png

比对质量统计

2.7 相关性分析

2.7.png

样品间相关性检查

2.8 R ea d s分布

2.8.png

   全基因组上R e a d s分布图

2.8.1 覆盖度

2.8.2 在染色体分布

2.8.3 在Repea ts区域分布

2.8.4 在功能元件分布

3 P ea k s识别

3.1 F r a g_ si ze预测

3.1.png

F r a g _ si z e分布图

3.2 覆盖度

3.2.png

P e a k s覆盖深度分布图

3.3 长度分布

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P e a k s长度的密度分布图

3.4 在染色体分布

3.4.png

染色体上P e a k s的分布图

3.5 在功能元件分布

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基因组不同区域上的P e a k s分布图

3.6 显著程度分布

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P e a k s显著程度分布图

3.7 富集倍数分布

3.8 峰顶个数

4 R ea d s分布

4 .1 TSS上下游

4 .2 TE S上下游

4 .3 峰顶上下游R ea d s分布

5 差异分析

5.1 P ea k s区域R ea d s富集分析

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不同样本P e a k的相关性层次聚类图

5.1-2.png

不同样本间的相关性热图

5.1-3.png

样本富集程度分布图

5.1-4.png

不同样本P e a k的相关性层次聚类图

5.1-5.png

不同样本间的相关性热图

5.1-6.png

样本富集程度分布图

5.2 P ea k s富集倍数分析

5.2.png

富集程度差异分布图

5.3 P ea k s差异分析

5.4 差异相关基因分析

5.4.png

两个样品中P e a k s相关基因V e nn图

6 富集分析

6 .1 G O 富集分析

6.1.png

P e a k s相关基因的W e g o图

6.1.1 GO 统计

6.1.2 GO 富集DAG图

6.1.3 显著功能富集分析

6 .2 K E G G 富集分析

6.2.1 KEGG通路分析

6.2.2 显著功能富集分析

显著功能富集分析.png

P e a k s相关基因的K E G G富集散点图

6.2.3 富集通路图

富集通路图.png

K E G G生物学通路图

7 参考文献

8 帮助说明

8 .1 IG V 使用说明

FAQ

1ChIP-Seq的主要研究领域有哪些?

1)判断DNA链的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰;

2)检测RNA polymerase II及其它反式因子在基因组上结合位点的精确定位;

3)研究组蛋白共价修饰与基因表达的关系;

4CTCF转录因子研究。

2、哪些因素会影响 ChIP-Seq 的结果?

抗体的质量与特异性、实验设计、ChIP 的实验操作、DNA 片段长度范围、测序深度、测序质量等都会影响ChIP-Seq 的结果。

3、样品制备过程中是否需要 PCR 扩增?PCR 扩增后是否会影响最后的结果?

由于 ChIP 下来的 DNA 样品量通常非常少,所以在样品制备过程中需要经过一步 PCR 扩增,主要是为了获得足够上机反应的 DNA 量。如果提供的 DNA 样品足量,可减少 PCR 循环数或不进行 PCR 扩增。PCR 扩增有可能增加结果的偏向性。

4、哪些物种可以做ChIP-Seq

物种为2倍体,基因拼接至染色体水平(NCBI),注释完整(GTF文件)即可。

5InputIP样本之间的关系是什么?

InputIP属于两个样本,在前期检测、建库、测序都是平行进行的,但是分析中需要将两个样本的测序数据进行整合分析,得出最终的peak结果,并进行后续分析。

6Input是什么?有什么作用?

我们将DNA或者RNA片段化后,在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照(不进行免疫沉淀过程)。Input是断裂后的基因组DNA或者RNA,需要与沉淀后的样品DNA/RNA一起经过逆转交联,DNA/RNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。通过后续数据分析,我们可以通过Input对照排除背景噪音(排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks),验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果,所以Input对照是IP-seq实验必不可少的步骤。

7、阳性对照和阴性对照是什么?

阳性对照

一般用anti-RNA polymerase II抗体,因为RNA polymeraseII是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区,因此理论上,ChIPPCR会有条带。一般阳性对照不进行测序。

阴性对照

阴性对照分为mockInput两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异性结合,或者实验过程,没发生结合的DNA清楚不完全,可能会出现条带,但是一般条带亮度较弱。IgG不需要进行测序,只是判断IP试验中所选取的抗体是否特异。

8起始细胞的量

起始细胞量在5*10e6以上,如果细胞量太少,ChIP富集得到的量很少,不一定能满足后续的实验要求。细胞量也不宜过多,细胞量太多会影响染色质打断的效果。我们推荐超声破碎时细胞密度不要高于1*10e7/mL。也可以通过超声破碎之后chromatin的量来定量。一般做组蛋白和组蛋白修饰的ChIPchromatin量在7-10ug;对于结合位点比较多的转录因子,chromatin的量在15-20ug;对于结合位点很少的转录因子和蛋白,推荐使用20-30ugchromatin 进行IP实验。

9甲醛交联应该注意什么

甲醛对人体有害,操作**在通风厨中进行。甲醛交联的终浓度为1%,时间一般为10-15min。交联的时间过长会影响超声破碎的效果。一般培养细胞交联10min,组织样品交联15min。交联之后立即用终浓度125mM的甘氨酸中和甲醛,终止交联。交联时间延长会影响染色质打断的效果,也会增加蛋白和DNA非特异性的结合。

10ChIP 超声波打断的效果

不同的细胞和组织,超声破碎的条件不太一样,如果处理的细胞之前没有做过ChIP实验,不知道超声条件的,在正式实验之前,需要摸索超声破碎的条件。超声破碎处理时间不宜过长,时间过长会影响蛋白和DNA的结合,也可能会破坏蛋白的结构,影响ChIP实验富集的效果。超声打断时间太短会导致染色质片段偏大,PCR扩增过程中引入背景信号。

11ChIP 实验对抗体的要求

ChIP 实验对抗体要求很高,需要抗体的特异性和亲和性都很强。如果抗体的特异性不好,最终IP富集到很多非特异性的DNA序列。如果抗体的亲和性不好,最终富集到的DNA量会很少。由于ChIP实验过程中会使用甲醛交联处理,会导致蛋白的结构发生变化,普通能做WBIP的抗体,不一定能满足ChIP的实验要求。在正式的ChIP实验之前,**提前验证抗体是否满足ChIP或者IP级别。

12ChIP 实验抗体的使用量

抗体的量可以根据超声破碎之后chromatin的量来确定。我们推荐10ugchromatin加入3-5ugChIP级别抗体。抗体量太少最终富集的DNA浓度偏低,抗体过多会增加背景。

13ChIP 实验引物的设计

ChIP实验结果的检测需要设计阴性和阳性引物进行PCR扩增。ChIP引物的设计非常关键。如果引物设计有问题,很可能导致ChIP实验成功了,但是检测结果是假阴性的,也可能发生ChIP 实验失败了,但是检测结果是假阳性的。

14靶基因的选择

ChIP 靶基因的选择可以参考已经发表的文章,另外像ENCODEroadmap等项目已经做过很多组蛋白修饰和转录因子的ChIP-Seq实验,也可以从这些已经发表的数据中查找目的蛋白结合区域和靶基因。

15ChIP-Seq对抗体要求有多高?

要做好ChIP-Seq,满足要求的抗体是至关重要的,一般客户选择文献中报道的抗体来做实验,但是抗体有运输和批次间差异问题,所以很多时候买到的抗体大部分是不满足该实验要求的,ABclonal整合了全球的ChIP-Seq抗体资源,每种抗体都大包装备有库存,来解决客户遇到的最棘手的问题。

16做好ChIP-Seq实验关键技术点有哪些?

染色质的打断和高特异性的抗体是ChIP-Seq实验的关键。ChIP-SeqDNA片段的要求一般为200-800bpDNA的打断可以通过酶切或者超声破碎的方法。对于不同用量的细胞或者组织样品,通常需要摸索最适的酶切或者超声破碎条件。抗体主要依赖其高亲和力和高特异性,且商业化抗体选择有非常多的经验讲究。

17能够做ChIP-Seq的靶点主要是哪些领域的蛋白?

主要集中在组蛋白修饰位点、表观遗传因子和转录因子等能够和DNA结合的靶点蛋白。

18ChIP-Seq需要样本量以及样本运输等问题?

交联细胞(优先):3X107,需甲醛、甘氨酸等处理,保留细胞沉淀,干冰运输。
具体操作:
A
、收获细胞:收集3~5X107细胞,即最少用1250px dish 培养皿的细胞。
交联:在室温下,加入终浓度为1%的甲醛(具体体积根据培养皿中的培养基的量进行计算,我们用的是国药初始浓度为37%左右的产品,直接在培养基中加入即可),混匀,交联小幅摇晃10min;注:交联程度过低则不能有效得到蛋白质-DNA复合物,交联程度过高则很难打断DNA。然后加入终浓度为0.125M的甘氨酸(起始浓度为2.5M,用蒸馏水配置),混匀后,静置5min;注:培养基颜色会变黄。
离心收集:对于悬浮细胞,直接3000rpm 离心1-2min收集细胞,然后PBS清洗3次(加入1ml 1X PBS(pH7.4)洗细胞后3000rpm离心1-2min,去上清。);对于贴壁细胞,使用细胞刮刀将细胞刮下,收集到EP管中,1X PBS (pH 7.4)清洗2-3次。去上清后,将细胞冻存在-80℃冰箱,运输时使用干冰运输。
B
、活细胞:1X106细胞放入培养瓶,装满培养基后常温运输。
准备指数生长期细胞,尽量不要让细胞太满,否则容易脱落,运输前给细胞换液,培养液装满培养瓶(瓶口、瓶盖多在酒精灯上烧烧,一般不会污染),封口胶密封。棉花裹紧,放在泡沫盒里即可。
C
、动物组织样品:0.5-2g组织样品,通过干冰运输。对于较大的组织需要先切成1-5mm的组织块。
D
、植物组织:5-20g
RNA-Seq
要求与ChIP相同。将组织和细胞放Trizol裂解液中,干冰运输。

19ChIP-Seq测序数据一般需要多大?

不同DNA结合蛋白或者组蛋白修饰在基因组上的分布差异很大,因此通过ChIP-Seq对这些DNA结合蛋白或者组蛋白修饰进行研究对测序数据量的要求也有很大的差异。转录因子等反式作用因子的测序数据量要求10-20Mreads数目,组蛋白修饰测序数据量要求20-40Mreads数目。

20ChIP-Seq结果数据分析注意事项以及ABclonal个性化数据分析特点

ABclonalChIP-Seq数据分析包括基本分析和个性化分析。基本分析包括测序数据的质量控制,测序数据比对到基因组上,ChIP-Seq数据在全基因上的不同区域分布趋势,ChIP-Seq富集peaks的查找,ChIP-Seq peaks区域目的基因的GO功能注释和pathway分析,查找转录因子或者反式作用因子结合的motif。个性化分析我们可以和客户协商,针对不同的研究内容调整分析策略。针对于不同转录因子或者组蛋白修饰在基因组上分布的差异,我们在分析过程中会采取不同的分析策略。

21ChIP-Seq对照组的概述

由于ChIP-Seq实验操作过程中涉及到DNA的打断和抗体富集等诸多因素的影响,对照组的选择是至关重要的。ChIP-Seq对照的选择有三种:Input,阳性对照和阴性对照。InputChIP实验过程中打断的DNA片段,是不通过抗体富集,直接逆交联再纯化得到DNAInput对照可以用于检测DNA打断的效果,以及作为背景信号用于后期的ChIP-Seq数据分析,找到目的蛋白在基因组上富集的区域。阳性对照通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体,常用的包括组蛋白抗体或RNAPolymerase II抗体等。阴性对照通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG或血清。

22ChIP-Seq数据对提高文章水平的重要性

ChIP-Seq技术是在全基因组范围上研究DNA结合蛋白和组蛋白修饰以及核小体的分布情况。相对于ChIPChIP-ChIP技术来说,ChIP-Seq灵敏度和分辨率都有很大的提高,而背景相对较低。ChIP-Seq数据可以提供给研究人员大量的信息,目前表观遗传学领域的高水平文章基本都会用到ChIP-Seq的数据。

23ChIP-Seq能做哪些样本和指标?

根据客户实验物种和研究指标,将实验难度分为四个等级:
**等级:人、大小鼠组蛋白修饰;
第二等级:人、大小鼠外其他动、植物样品组蛋白修饰,人、大小鼠热门转录因子;
第三等级:人、大小鼠外其他动、植物样品热门转录因子,人、大小鼠非热门转录因子;
第四等级:标签类转录因子。