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DNA中5-hmC图谱测定

5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是5-甲基胞嘧啶(5mC)的主动去甲基化过程中的重要中间产物,被称为“第六种DNA碱基”。2009年两篇science文章发现了TET酶可以将5mC氧化成5hmC并在生理上发挥着重要的作用,5hmC也迅速成为科研的热点。在接下来的几年中,科学家发现5hmC和5mC一样,是一种重要的表观遗传修饰。5hmC的基因分布可以精准对应基因活性调控,比5mC更加动态灵敏地反应基因表达状态。2012年时,《Cell》杂志就有文章报道羟甲基胞嘧啶与黑色素瘤之间的紧密关系(Lian et al.,2012)。随后又有多篇有影响力的学术文章进一步验证了羟甲基胞嘧啶作为细胞发育、神经系统、肿瘤以及心血管疾病等的标记物。

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同表观遗传修饰5mC一样,结合高通量测序的方法绘制特定情形下5hmC在全基因组上的基因图谱显得尤为重要。通过了解DNA中羟甲基化胞嘧啶在基因组上的分布,可以对应分析基因组的调控信息。

我们的DNA羟甲基化检测技术原理来自于2011年美国芝加哥大学何川教授发表在NatureBiotechnology的专利技术(Song et al., 2011)。该技术是利用糖基转移酶的作用将含有叠氮基团的葡萄糖特异性的共价标记到片段化DNA的5hmC上,然后再通过高效的点击化学反应接上biotin进行可实现高效的富集并构建DNA文库;利用高通量测序并比对分析的方法即可以获得5hmC在基因组上的分布情况。对于抗体富集的方法,该方法的富集效率更高,5hmC的基因图谱更加精确。

2016年,何川教授实验室对该技术细节进行了优化,其nano-hmC-Seal的技术可检测低至1000个细胞基因组中的5hmC修饰分布情况(Han et al., 2016)。他们利用该技术检测白血病模式小鼠中造血干细胞的5hmC图谱,发现5hmC分布在白血病样品与野生型样品中有显著差异,并获得了不同类型造血干细胞中的羟甲基化差异性区域的序列特征(如下图所示)。基于nano-hmC-Seal技术,我们实现了5hmC标记并富集等流程的标准化操作,具有极高的灵敏度,精准稳定的检测来源更为广泛的DNA样本:1),从DNA使用量上看,该技术可操作低至1ng的游离核酸,高至1ug的组织样本DNA;2),结合高通量测序,该技术可以分析任意物种中含有5hmC修饰的DNA样本,进而分析其生理调控机制。

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技术参数

名称:5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测定和分析

技术名称:nano-hmC-Seal

DNA用量:1ng-1ug(具体情况会根据5hmC在该物种中的含量进行小范围调整)

测序策略:NextSeq500/Hiseq X10,PE38/PE150

数据量:平均1.5G/6G,读段数量2千万以上

周期:少量样本(<10)25个工作日给出基本解读分析;批量样品根据实验要求协商数据循环周期。

实验流程

采集样本-运输质检-提取DNA-文库构建-5hmC富集扩增-质控测序-数据解读-数据报告并反馈

数据分析

基本解读:测序数据比对至基因组,给出样本在基因区域的羟甲基化含量分布

深度解读:在对照组与实验组之间进行统计分析,找出羟甲基化含量分布的显著差异,出具报告辅助临床诊断与治疗。

样本要求

人:8ml外周血或者相关组织样品,及其相关临床资料(性别、年龄、基本诊断等,作为临床分析用);

其他物种:组织样品DNA或者较大量的血液。

服务范围

各类物种或者其他来源DNA中的5-羟甲基胞嘧啶基因图谱绘制和对比分析;

各类肿瘤临床研究,包括肿瘤标记物的寻找、组织活检、液体活检、术后监控和用药指导的研究;

专业人员辅助实验设计,定制个性化的5-羟甲基胞嘧啶科研方案;

服务特色

该技术检测灵敏度极高,样品收集方便,起始样本量少;标准化流程操作,避免因操作造成的偏差;

表观遗传新领域,全基因组比对,获取全基因组的羟甲基化分布,信息量大;

根据个性化科研方案提供专业的且具有特色的数据分析,满足发表文章的要求。

参考资料

Han,D., Lu, X., Shih, A. H., Nie, J.,You, Q., Xu, M. M., . . . He, C. (2016). AHighly Sensitive and Robust Methodfor Genome-wide 5hmC Profiling of Rare CellPopulations. Mol. Cell, 63(4),711-719. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.028

Lian,C. G., Xu, Y., Ceol, C., Wu, F.,Larson, A., Dresser, K., . . . Shi, Y. G.(2012). Loss of 5-hydroxymethylcytosineis an epigenetic hallmark of melanoma.Cell, 150(6), 1135-1146. doi:10.1016/j.cell.2012.07.033

Song,C. X., Szulwach, K. E., Fu, Y.,Dai, Q., Yi, C., Li, X., . . . He, C. (2011).Selective chemical labelingreveals the genome-wide distribution of5-hydroxymethylcytosine. Nat Biotechnol,29(1), 68-72. doi: 10.1038/nbt.1732