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分析模块复制输入文件到项目工作目录中，模块输出即为复制的拷贝，复制到项目中的文件内容与原文件一致。在项目中，常用于中转多个模块的输入。 输入： 源文件。 输出： 拷贝文件。 应用场景示例：
分析模块在项目工作目录中创建输入文件链接，类似于快捷方式，模块输出即为创建的链接文件。链接文件指向源文件，相比于文件复制，节省了硬盘空间。在项目中，常用于中转多个模块的输入。 输入： 源文件。 输出： 链接文件。 应用场景示例：
分析模块输入xls格式的Excel表格文件，将其中的表格内容转化为制表符分隔的文本文件。
输入： xls格式的Excel表格文件。
输出： 制表符分隔的文本文件。
说明： 分析模块进行数据转换的效率低，速度慢，运行时间长！建议通过Excel软件直接进行格式转换，从而得到制表符分隔的文本文件。 步骤如下（Excel 2007版本）： 1、Excel软件打开xls文件，选择 "另存为" �C> "其他格式" 。 2、保存类型选择：文本文件(制表符分隔)(*.txt)。
3、接着点击 "确定" 和 "是" 。 4、关闭Excel软件。 分析模块，输入Windows/Dos文本文件，输出Unix文本文件。例如换行符，Unix用 "\n" 表示，Windows用 "\r\n" 表示。
输入： Windows/Dos文本文件。
输出： Unix文本文件。
说明： Unix文本文件和Windows/Dos文本文件的格式区别参考维基百科：（https://en.wikipedia.org/wiki/Newline）。 分析模块，输入Unix文本文件，输出Windows/Dos文本文件。例如换行符，Unix用 "\n" 表示，Windows用 "\r\n" 表示。
输入： Unix文本文件。
输出： Windows/Dos文本文件。
说明： Unix文本文件和Windows/Dos文本文件的格式区别参考维基百科：（https://en.wikipedia.org/wiki/Newline）。 分析模块，输入一个文本文件，将文件中所有用户指定的分隔符转换为制表符，输出制表符分隔的表格文本文件。连续分隔符会被认为是一个分隔符，如果列被5个空白字符分隔，将会转换为1个制表符。
输入：
txt格式的文本文件： chrX||151283558|151283724|NM_000808_exon_8_0_chrX_151283559_r|0|- chrX|151370273|151370486|NM_000808_exon_9_0_chrX_151370274_r|0|- chrX|151559494|151559583|NM_018558_exon_1_0_chrX_151559495_f|0|+ chrX|151564643|151564711|NM_018558_exon_2_0_chrX_151564644_f||||0|+
参数设置为将所有竖线(Pipes）字符转换为制表符(Tabs)。
输出：
制表符分隔的表格文本文件：
分析模块，将输入的多个文件从头到尾进行连接。比如，连接合并多个fastq原始数据文件成一个文件。 不同类型的文件需要小心进行连接合并，分析模块并不会进行文件格式的确认。
输入： 1、数据文件一：
2、数据文件二：
3、数据文件三：
输出： 连接合并后的结果文件：
分析模块，输入制表符分隔的表格文本文件，根据指定列，进行切列操作，从而得到提取出相应列的表格数据文件。 l 列号用c1,c2指定，逗号分隔，以此类推。列号从1开始计数。 l 列号可以任意顺序进行指定，比如c2,c1,c6 。 l 如果指定的列在输入数据中不存在，则用符号 "-" 进行填充。 l c1-c5表示从第1列到第5列数据。
输入：
数据文件(6列：c1, c2, c3, c4, c5, c6）：
输出：
指定 "c1,c4,c6" 将输出：
指定 "c6,c5,c4,c1" 将输出：
指定 "c1-c3" 将输出：
指定 "c8,c7,c4" 将输出：
分析模块，输入两个制表符分隔的表格文本文件，进行列合并操作。
输入：
1、数据文件一：
2、数据文件二：
输出：
列合并后的文件：
分析模块，提取输入文件头部前n行作为输出。
输入：
取前2行，从数据文件：
输出：
结果文件：
分析模块，输入两个制表符分隔的表格文本文件，根据两个文件中分别指定的列作为关键字进行数据的整合，合并输出具有相同关键字的行。
输入：
1、数据文件一：
2、数据文件二：
参数设置为以**个文件的第4列，第二个文件的第1列作为关键字进行合并。
输出：
结果文件：
分析模块，在一个数据集指定列中查找与另一个数据集指定列匹配或不匹配的行。
输入：
1、数据文件一：
2、数据文件二：
输出：
在数据文件一第4列中查找，与数据文件二第1列匹配的行，将输出：
在数据文件一第4列中查找，与数据文件二第1列不匹配的行，将输出：
分析模块实现了扩增子分析从原始数据到OTU表的一键化分析流程，串联分析模块 "Trimmomatic PE(paired-end)" 进行原始数据质控，分析模块 "Using FLASH to merge paired-end reads" 进行PE reads组装，分析模块 "Vsearch: otu cluster and mapping" 进行OTU聚类。 详细说明，参考相应分析模块的帮助文档。该分析模块的默认参数适用于绝大多数的16S、ITS通用引物，如无特殊情况，不需要进行参数的修改。
输入： 原始测序数据配置文件，可通过项目编辑窗口中的右键菜单 "Create OTU Cluster Config File" 获得。操作步骤见下方说明。 示例：
说明：制表符分隔的文本文件，**列为样品名，第二列为PE测序一端FASTQ原始测序数据的绝对路径，第二列为另一端FASTQ原始测序数据的绝对路径。 注意：文件从盘符开始的绝对路径请不要包含中文字符、空白字符等特殊字符。
输出：
1、OTU Table表格文件
2、OTU代表序列文件 >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
3、HTML格式表示的每个样品质控和组装日志，以及每个样品FASTA格式的优化序列文件。示例如下所示：
"Create OTU Cluster Config File" 操作说明： 1、在项目编辑窗口中点击右键菜单 "Create OTU Cluster Config File"，弹出创建配置文件对话框，如下所示：
2、点击 "Add Fastq Files" 按钮添加原始测序数据，并设置匹配的文件后缀名，具体操作说明见界面提示，然后点击 "OK" 按钮，如下所示：
3、在项目编辑窗口中，将会生成一个 "otuCls_config.txt" 文件，可以作为分析模块的输入，如下所示：
4、生成的文件内容如下所示：
分析模块引用了Trimmomatic v0.32 软件( http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic )。 分析模块引用了FLASH v1.2.11软件（https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）。 分析模块引用了Vsearch v2.9.1软件（https://github.com/torognes/vsearch）。
相关文献如下所示： Bolger, A.M., Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, btu170. FLASH: Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. T. Magoc and S. Salzberg. Bioinformatics 27:21 (2011), 2957-63. Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C., & Mahé, F. (2016). VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ, 4, e2584. 分析模块利用Usearch软件进行OTU聚类分析，得到OTU Table文件和OTU代表序列文件。在样本量不大的情况下，使用32位Usearch软件可以得到比Vsearch软件更准确的OTU聚类结果。
输入：
HTML格式表示的每个样品优化序列文件，可由分析模块 "One Step Automate Analysis: 1.QC 2.Assembly 3.OTU Cluster" 获得，示例如下所示：
输出：
1、OTU Table表格文件
2、OTU代表序列文件 >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
使用示例：
分析模块引用了Usearch v8.1.1861软件（http://www.drive5.com/usearch/manual/）。
相关文献如下所示： USEARCH and UCLUST algorithms： Edgar,RC (2010) Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST, Bioinformatics 26(19), 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461 UCHIME algorithm： Edgar,RC, Haas,BJ, Clemente,JC, Quince,C, Knight,R (2011) UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection, Bioinformatics doi: 10.1093/bioinformatics/btr381 [PMID 21700674]. UPARSE algorithm： Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads, Nature Methods [Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604]. FASTQ格式的原始测序数据文件：
设置原始数据质量值编码方式：1、Solexa 2、Illumina 1.3-1.7 3、Sanger/Illumina 1.8+ 注：对于Illumina测序平台，从左到右分别对应，极早期机器、早期机器，当前或以后机器。参数的默认值为 Sanger/Illumina 1.8+， 对应目前国内测序公司主流测序仪。 关于FASTQ格式文件，请参考维基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTQ_format
输出：
每个测序循环下所有reads碱基数和质量值统计表：
其中，从左到右，每一列含义，如下所示：
运用统计学方法，统计每个测序循环下所有reads的碱基分布情况。 分析模块通过生成碱基分布叠层直方图，直观地反应测序reads的碱基分布情况。 常规测序（如转录组，基因组）的前几个循环，A、T、C、G的丰度有所波动，后面趋于稳定。一般情况下A与T相等，C与G相等，各碱基所含百分比会因物种的差异而不同，未知碱基所占百分比越低，说明测序文库质量越好。 对于扩增子测序，由于不是随机打断建库测序，不符合以上的碱基分布规律，主要看未知碱基的含量。
输入：
测序结果统计报告表，由分析模块 "FASTQ Summary Statistics" 生成。 示例：
输出：
测序数据碱基分布叠层直方图。 示例： 1、对于基因组或转录组测序，下图展示了一个良好的测序结果。其中，前5个碱基为barcode序列：GATCT，A碱基含量基本等于T碱基、C碱基含量基本等于G碱基。
2、对于基因组或转录组测序，下图展示了一个很差的测序结果。碱基含量不符合碱基互补配对原则，很可能由于接头序列污染导致。
3、下图展示了一个很差的测序结果，N碱基含量较高，很可能由于测序仪器进行测序出现问题导致。
4、对于扩增子测序，由于扩增产物序列具有确定性（非随机打断测序），通常呈现下图所示的分布情况。
运用统计学的方法，对所有测序循环下所有reads的质量值进行统计，从宏观上直观地反应测序实验数据质量。 分析模块通过生成，测序质量值箱线图，直观地反应文库的测序质量。 测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。 通常序列5’端前几个碱基的错误率相对较高，随着测序的进行，酶的活性及其他物质的灵敏度也会下降，所以达到一定测序长度后，测序质量值也随之下降。
输入：
测序结果统计报告表，由分析模块 "FASTQ Summary Statistics" 生成。 示例：
输出：
测序数据质量值箱线图。 说明： 1、Black horizontal lines are medians. 2、Rectangular red boxes show the Inter-quartile Range (IQR) (top value is Q3, bottom value is Q1). 3、Whiskers show outlier at max. 1.5*IQR.
示例： 1、下图展示了一个优良的测序结果，对于大多数循环，质量值中位数为40。
2、下图展示了一个相对不错的测序结果，在后续循环中，质量值中位数出现了下降。
3、下图展示了一个很差的测序结果，质量值中位数出现了快速下降。
分析模块封装了Trimmomatic工具，Trimmomatic是一个针对Illumina高通量测序的reads trim工具，支持paired-end（双末端）和single-end（单末端）数据。 Trimmomatic包括如下功能： l ILLUMINACLIP: Cut adapter and other illumina-specific sequences from the read l SLIDINGWINDOW: Perform a sliding window trimming, cutting once the average quality within the window falls below a threshold l MINLEN: Drop the read if it is below a specified length l LEADING: Cut bases off the start of a read, if below a threshold quality l TRAILING: Cut bases off the end of a read, if below a threshold quality l CROP: Cut the read to a specified length l HEADCROP: Cut the specified number of bases from the start of the read
输入： 对于single-end（单末端）数据，输入单个FASTQ文件。 对于paired-end（双末端）数据，输入两个FASTQ文件（R1和R2）。
设置质量值参数，Illumina 1.3-1.7 Phred+64 对应Illumina早期平台，Illumina 1.8+ Phred+33 对应Illumina最新平台，默认参数为：Illumina1.8+ Phred+33。
输出： 对于single-end（单末端）数据，输出修剪和过滤的clean data数据，为单个FASTQ文件。 对于paired-end（双末端）数据，输出四个文件，分别为： 两个FASTQ文件(R1-paired and R2-paired)，包含read的两端pair（R1和R2）均通过数据质控的结果文件。 额外的两个FASTQ文件(R1-unpaired and R2-unpaired)，包含read其中一端pair（R1 或 R2）通过数据质控，另一端无法通过数据质控，这样，就仅保留了一端的数据结果。
附录： 对于扩增子测序，MiSeq PE 250/300，建议使用如下参数设置：
即，过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read。
分析模块引用了Trimmomatic v0.32 软件( http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic )。
相关文献如下所示： Bolger, A.M., Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, btu170. 分析模块封装了Trimmomatic工具，Trimmomatic是一个针对Illumina高通量测序的reads trim工具，支持paired-end（双末端）和single-end（单末端）数据。 Trimmomatic包括如下功能： l ILLUMINACLIP: Cut adapter and other illumina-specific sequences from the read l SLIDINGWINDOW: Perform a sliding window trimming, cutting once the average quality within the window falls below a threshold l MINLEN: Drop the read if it is below a specified length l LEADING: Cut bases off the start of a read, if below a threshold quality l TRAILING: Cut bases off the end of a read, if below a threshold quality l CROP: Cut the read to a specified length l HEADCROP: Cut the specified number of bases from the start of the read
输入： 对于single-end（单末端）数据，输入单个FASTQ文件。 对于paired-end（双末端）数据，输入两个FASTQ文件（R1和R2）。
设置质量值参数，Illumina 1.3-1.7 Phred+64 对应Illumina早期平台，Illumina 1.8+ Phred+33 对应Illumina最新平台，默认参数为：Illumina1.8+ Phred+33。
输出： 对于single-end（单末端）数据，输出修剪和过滤的clean data数据，为单个FASTQ文件。 对于paired-end（双末端）数据，输出四个文件，分别为： 两个FASTQ文件(R1-paired and R2-paired)，包含read的两端pair（R1和R2）均通过数据质控的结果文件。 额外的两个FASTQ文件(R1-unpaired and R2-unpaired)，包含read其中一端pair（R1 或 R2）通过数据质控，另一端无法通过数据质控，这样，就仅保留了一端的数据结果。
附录： 对于扩增子测序，MiSeq PE 250/300，建议使用如下参数设置：
即，过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50bp的窗口，如果窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50bp以下的read。
分析模块引用了Trimmomatic v0.32 软件( http://www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic )。
相关文献如下所示： Bolger, A.M., Lohse, M., & Usadel, B. (2014). Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics, btu170. 分析模块，将FASTQ格式的测序数据文件转换为FASTA格式的序列文件。
输入：
FASTQ格式的原始测序数据文件： @081017-and-081020:1:1:1715:1759 GGACTCAGATAGTAATCCACGCTCCTTTAAAATATC + II#IIIIIII$5+.(9IIIIIII$%*$G$A31I&&B
输出：
FASTA格式的序列数据文件： >081017-and-081020:1:1:1715:1759 GGACTCAGATAGTAATCCACGCTCCTTTAAAATATC
更多，关于FASTA格式文件，请参考维基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA_format 分析模块，计算FASTA格式序列文件中，每一条序列的长度信息。
输入：
FASTA格式的序列数据文件： >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
序列长度信息文件：
其中，**列为序列名，第二列为序列长度。
关于FASTA格式文件，请参考维基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA_format 分析模块，根据限定的序列长度信息（Minimal length and Maximum length），输出指定长度范围内的序列。 扩增子测序中，通常在MiSeq PE两端数据组装之后，OTU聚类之前，过滤长度太短的测序片段。
输入：
FASTA格式的序列数据文件： >seq1 TCATTTAATGAC >seq2 ATGGC >seq3 TCACATGATGCCG >seq4 ATGGAAGC
设置参数Minimal length：10, Maximum length：0。
输出：
根据长度过滤后的序列文件： >seq1 TCATTTAATGAC >seq3 TCACATGATGCCG
关于FASTA格式文件，请参考维基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA_format 分析模块，输入FASTA格式序列文件，输出序列统计信息。
输入：
FASTA格式的序列数据文件： >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
序列统计信息文件：
包含的信息：
关于FASTA格式文件，请参考维基百科：https://en.wikipedia.org/wiki/FASTA_format 分析模块封装了FLASH（Fast Length Adjustment of SHort reads），FLASH根据PE reads之间的overlap关系，将成对reads拼接（merge）成一条序列。 注：只有初始DNA片段长度小于2倍read读长，即 PE reads测通，才能将双末端测序的paired-end reads拼接起来。
输入：
两个文件： 1、FASTQ格式的原始测序数据文件（R1 / first of pair）。 2、FASTQ格式的原始测序数据文件（R2 / second of pair）。
输出： 拼接后的序列文件，FASTQ格式文件。
注意： A、对于常规文库（如转录组，基因组）。 假定，一个DNA文库，文库长度均值为m=180bp，标准差为sd=18bp，测序读长为r=100bp，那么建议设置Maximum overlap为： 2*r - m + 2.5*sd = 65bp。 B、对于扩增子测序文库。 假定，16s扩增区域为，V4 + v5，扩增产物长度均值为m=400bp，标准差为sd=20bp，MiSeq测序读长为r=250bp，那么建议设置Maximum overlap为：2*r - m + 2.5*sd = 150bp
特别注意： 大多数情况下，测序read读长小于扩增产物长度，如下所示：
那么，通过两端reads尾部的overlap关系就可以将两端的reads拼接起来。
如果测序read读长大于扩增产物长度，如下所示：
可以看到，两端reads的尾部并不存在overlap关系，无法将两端reads拼接起来。 面对这种情况，需要在原始数据剪切和过滤时，同时将两端reads的尾部截掉，使得reads的读长小于扩增产物的长度。 在 "Trimmomatic PE(paired-end)" 分析模块中，设置CROP过程，将reads截短到需要的长度。
两端reads截短后，如下所示，通过尾部的overlap关系，即可拼接起来。
FLASH简介如下所示： FLASH (Fast Length Adjustment of SHort reads) is an accurate and fast tool to merge paired-end reads that were generated from DNA fragments whose lengths are shorter than twice the length of reads. Merged read pairs result in unpaired longer reads, which are generally more desired in genome assembly and genome analysis processes. Briefly, the FLASH algorithm considers all possible overlaps at or above a minimum length between the reads in a pair and chooses the overlap that results in the lowest mismatch density (proportion of mismatched bases in the overlapped region). Ties between multiple overlaps are broken by considering quality scores at mismatch sites. When building the merged sequence, FLASH computes a consensus sequence in the overlapped region. More details can be found in the original publication. Limitations of FLASH include: - FLASH cannot merge paired-end reads that do not overlap. - FLASH is not designed for data that has a significant amount of indel errors (such as Sanger sequencing data). It is best suited for Illumina data.
分析模块引用了FLASH v1.2.11软件（https://ccb.jhu.edu/software/FLASH/）。
相关文献如下所示： FLASH: Fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. T. Magoc and S. Salzberg. Bioinformatics 27:21 (2011), 2957-63. 分析模块，输入每个样品经过Trimmomatic剪切和过滤、FLASH拼接后的FASTA序列文件，运行得到OTU Table文件和OTU代表序列文件。 OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。 分析模块封装了Vsearch软件，具体分析步骤如下所示： l Vsearch --derep_prefix命令：合并所有样本相似的优化序列，并过滤丰度小于2的结果。 l Vsearch --cluster_size命令：按照97%相似性（默认参数）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列文件。 l Vsearch --usearch_global命令：将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%（默认参数）以上的序列，生成OTU Table文件。
输入： Trimmomatic剪切和过滤、FLASH拼接后的FASTA序列文件。 注：根据需要，在分析模块参数设置界面，动态增加或减少输入文件，并设置对应序列文件的样品名称。
输出：
1、OTU Table表格文件
2、OTU代表序列文件 >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
分析模块引用了Vsearch v2.9.1软件（https://github.com/torognes/vsearch）。
相关文献如下所示： Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C., & Mahé, F. (2016). VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ, 4, e2584. 分析模块，输入OTU代表序列，与16S、18S、ITS数据库比对，进行分类学分析，得到OTU分类学注释结果。 分析模块封装了Vsearch软件中的SINTAX算法，SINTAX采用非贝叶斯算法进行分类学分析。分析模块支持的数据库如下所示：
输入：
OTU代表序列文件： >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
1、Qiime格式的分类学注释结果文件：
2、SINTAX格式的分类学注释结果文件：
其中，**列为OTU名称；第二列为分类学注释详细信息，括号内为比对分值；第三列为比对方向。
分析模块引用了Vsearch v2.9.1软件（https://github.com/torognes/vsearch）。
相关文献如下所示：
Robert Edgar (2016) in SINTAX: a simple non-Bayesian taxonomy classifier for 16S and ITS sequences, BioRxiv, 074161. Preprint. doi: https://doi.org/10.1101/074161. Rognes, T., Flouri, T., Nichols, B., Quince, C., & Mahé, F. (2016). VSEARCH: a versatile open source tool for metagenomics. PeerJ, 4, e2584. 分析模块，输入每个样品经过Trimmomatic剪切和过滤、FLASH拼接后的FASTA序列文件，运行得到OTU Table文件和OTU代表序列文件。 OTU（Operational Taxonomic Units）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。 分析模块封装了Usearch软件，具体分析步骤如下所示： l Usearch -derep_prefix命令：对优化序列提取非重复序列，便于降低分析中间过程冗余计算量。 l Usearch -sortbysize命令：去除没有重复的单序列。 l Usearch -cluster_otus命令：按照97%相似性对非重复序列（不含单序列）进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU代表序列文件。 l Usearch -usearch_global命令：将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU Table文件。
输入： Trimmomatic剪切和过滤、FLASH拼接后的FASTA序列文件。 注：根据需要，在分析模块参数设置界面，动态增加或减少输入文件，并设置对应序列文件的样品名称。
输出：
1、OTU Table表格文件
2、OTU代表序列文件 >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
分析模块引用了Usearch v8.1.1861软件（http://www.drive5.com/usearch/manual/）。
相关文献如下所示： USEARCH and UCLUST algorithms： Edgar,RC (2010) Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST, Bioinformatics 26(19), 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461 UCHIME algorithm： Edgar,RC, Haas,BJ, Clemente,JC, Quince,C, Knight,R (2011) UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection, Bioinformatics doi: 10.1093/bioinformatics/btr381 [PMID 21700674]. UPARSE algorithm： Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads, Nature Methods [Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604]. 嵌合体从序列组成来说是指一条序列由两条或者更多条生物学序列连接而成，扩增子测序实验中，主要由于PCR阶段不完全延伸形成，形成的嵌合体会在随后PCR过程被放大。 分析模块，根据与16S数据库进行序列比对来去除嵌合体。分析模块支持的16S数据如下所示：
输入：
1、OTU Table表格文件
2、OTU代表序列文件 >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
1、过滤嵌合体后的OTU Table表格文件 2、过滤嵌合体后的OTU代表序列文件
分析模块引用了32位版本Usearch v8.1.1861软件（http://www.drive5.com/usearch/manual/）。
相关文献如下所示： UCHIME algorithm： Edgar,RC, Haas,BJ, Clemente,JC, Quince,C, Knight,R (2011) UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection, Bioinformatics doi: 10.1093/bioinformatics/btr381 [PMID 21700674]. 分析模块，输入OTU代表序列，与16S、ITS训练集数据库比对，进行分类学分析，得到OTU分类学注释结果。只能注释到属水平，但准确度更高。 分析模块封装了RDP Classifier软件，RDP Classifier采用贝叶斯算法进行分类学分析，支持数据库如下所示：
输入：
OTU代表序列文件： >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
1、Qiime格式的分类学注释结果文件：
2、RDP格式的分类学注释结果文件：
分析模块引用了RDP Classifier v2.11软件（https://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/）。
相关文献如下所示： Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, Cole JR. 2007. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy.Appl Environ Microb 73(16): 5261-5267. 分析模块，输入OTU代表序列，与16S、ITS训练集数据库比对，进行分类学分析，得到OTU分类学注释结果。只能注释到属水平，但准确度更高。 分析模块封装了Usearch中的Utax命令，Utax基于Kmer的方法进行分类学分析，支持数据库如下所示：
输入：
OTU代表序列文件： >OTU1 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCG >OTU2 GTAGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCG >OTU3 GTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCG
输出：
1、Qiime格式的分类学注释结果文件：
2、RDP格式的分类学注释结果文件：
分析模块引用了32位版本Usearch v8.1.1861软件（http://www.drive5.com/usearch/manual/）。
相关文献如下所示： USEARCH and UCLUST algorithms： Edgar,RC (2010) Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST, Bioinformatics 26(19), 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461 UCHIME algorithm： Edgar,RC, Haas,BJ, Clemente,JC, Quince,C, Knight,R (2011) UCHIME improves sensitivity and speed of chimera detection, Bioinformatics doi: 10.1093/bioinformatics/btr381 [PMID 21700674]. UPARSE algorithm： Edgar, R.C. (2013) UPARSE: Highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads, Nature Methods [Pubmed:23955772, dx.doi.org/10.1038/nmeth.2604]. 该分析模块用于生成分组信息文件。
输入： 分组1：Group Name：gp1，Sample Name：Bio1，Sample Name：Bio2 分组2：Group Name：gp2，Sample Name：Bio3，Sample Name Bio4
输出：
分组信息文件： Bio1 gp1 Bio2 gp1 Bio3 gp2 Bio4 gp2
！！建议使用以下方式生成样本分组信息文件： 1、在文件浏览器中，选中对应的OTU Table文件。
2、点击右键菜单 "New" -> "Sample Group File" ，弹出设置样本分组信息窗口。
或者在项目编辑窗口中，选中OTU Table输入文件，点击右键菜单 "Get group design file from otu_table ext." ，弹出设置样本分组信息窗口。 ！！注：文件格式必须是tabular，可通过 "Reset Format" 进行文件格式的更改。
3、设置分组信息，点击OK按钮得到对应的样本分组信息文件。
分析模块根据输入文件（OTU Table）的表头信息，生成对应的分组信息文件。
输入：
OTU Table表格文件
设置参数： 分组1：Group Name：group1，Column Range：2-4 分组2：Group Name：group2，Column Range：5-10
输出：
分组信息文件：
！！建议使用以下方式生成样本分组信息文件： 1、在文件浏览器中，选中对应的OTU Table文件。
2、点击右键菜单 "New" -> "Sample Group File" ，弹出设置样本分组信息窗口。
或者在项目编辑窗口中，选中OTU Table输入文件，点击右键菜单 "Get group design file from otu_table ext." ，弹出设置样本分组信息窗口。 ！！注：文件格式必须是tabular，可通过 "Reset Format" 进行文件格式的更改。
3、设置分组信息，点击OK按钮得到对应的样本分组信息文件。
格式转换工具，将biom格式转换为table格式。
输入： biom格式的OTU Table文本文件
输出：
制表符分隔的OTU Table表格文件
biom格式参考：http://biom-format.org/ 相关文献如下所示： The Biological Observation Matrix (BIOM) format or: how I learned to stop worrying and love the ome-ome. Daniel McDonald, Jose C. Clemente, Justin Kuczynski, Jai Ram Rideout, Jesse Stombaugh, Doug Wendel, Andreas Wilke, Susan Huse, John Hufnagle, Folker Meyer, Rob Knight, and J. Gregory Caporaso.GigaScience 2012, 1:7. doi:10.1186/2047-217X-1-7 格式转换工具，将table格式转换为biom格式。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
输出： biom格式的OTU Table文本文件
biom格式参考：http://biom-format.org/ 相关文献如下所示： The Biological Observation Matrix (BIOM) format or: how I learned to stop worrying and love the ome-ome. Daniel McDonald, Jose C. Clemente, Justin Kuczynski, Jai Ram Rideout, Jesse Stombaugh, Doug Wendel, Andreas Wilke, Susan Huse, John Hufnagle, Folker Meyer, Rob Knight, and J. Gregory Caporaso.GigaScience 2012, 1:7. doi:10.1186/2047-217X-1-7 格式转换工具，将table格式转换为biom格式，并添加OTU物种分类信息。
输入：
1、制表符分隔的OTU Table表格文件
2、OTU分类学注释信息文件
输出： biom格式的OTU Table文本文件，其中包含OTU的物种分类信息。
biom格式参考：http://biom-format.org/ 相关文献如下所示： The Biological Observation Matrix (BIOM) format or: how I learned to stop worrying and love the ome-ome. Daniel McDonald, Jose C. Clemente, Justin Kuczynski, Jai Ram Rideout, Jesse Stombaugh, Doug Wendel, Andreas Wilke, Susan Huse, John Hufnagle, Folker Meyer, Rob Knight, and J. Gregory Caporaso.GigaScience 2012, 1:7. doi:10.1186/2047-217X-1-7 分析模块生成各分类学水平样本序列数统计表，或各分类学水平相对丰度信息表。
输入： biom格式的OTU Table文本文件，其中包含OTU的物种分类信息，可由分析模块 "Convert table to biom with taxonomy assignment information" 生成。
设置参数：
分类学等级对应的结果依赖于进行分类学注释时所采用的数据库。不同的数据库，等级对应的结果不同。 例如，对于Greengenes 数据库，使用如下的分类学等级: Level 1 = Kingdom (e.g Bacteria), Level 2 = Phylum (e.g Actinobacteria), Level 3 = Class (e.g Actinobacteria), Level 4 = Order (e.g Actinomycetales), Level 5 = Family (e.g Streptomycetaceae), Level 6 = Genus (e.g Streptomyces), Level 7 = Species (e.g mirabilis). "
输出：
对应分类水平Taxon Table表格文件
分析模块引用了Qiime（v1.9.0）中的summarize_taxa.py脚本。
相关文献如下所示： QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data J Gregory Caporaso, Justin Kuczynski, Jesse Stombaugh, Kyle Bittinger, Frederic D Bushman, Elizabeth K Costello, Noah Fierer, Antonio Gonzalez Pena, Julia K Goodrich, Jeffrey I Gordon, Gavin A Huttley, Scott T Kelley, Dan Knights, Jeremy E Koenig, Ruth E Ley, Catherine A Lozupone, Daniel McDonald, Brian D Muegge, Meg Pirrung, Jens Reeder, Joel R Sevinsky, Peter J Turnbaugh, William A Walters, Jeremy Widmann, Tanya Yatsunenko, Jesse Zaneveld and Rob Knight; Nature Methods, 2010; doi:10.1038/nmeth.f.303 分析模块将OTU Table中同一分组样品的OTU序列数进行合并输出。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
设置参数： 分组1：Group Name：group1，Samples in this group, Numerical columns：2,3,4 分组2：Group Name：group2，Samples in this group, Numerical columns：5,6,7 分组3：Group Name：group3，Samples in this group, Numerical columns：8,9
输出：
各组OTU丰度信息表
分析模块将OTU Table中样品的OTU序列数进行均一化，使得每个样品的OTU序列数求和一致。均一化的数值设为1，则为相对丰度值。在处理过程中，每个样本只是简单的根据相对丰度进行等比例的放大和缩小。建议使用高级分析中的抽平模块（ "Creates a subsampled OTU table by random sampling of the absolute abundance OTU table" ），进行随机抽样，生成样本序列数一致的OTU Table。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
设置参数： 所有样本均一化为1000
输出：
每个样本单独均一化后的OTU Table文件：
群落生态学中研究微生物多样性，通过单样本的多样性分析（Alpha多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。 计算菌群丰度（Community richness）的指数有： Chao - the Chao1 estimator (http://www.mothur.org/wiki/Chao)； Ace - the ACE estimator (http://www.mothur.org/wiki/Ace)； 计算菌群多样性（Community diversity）的指数有： Shannon - the Shannon index (http://www.mothur.org/wiki/Shannon)； Simpson - the Simpson index (http://www.mothur.org/wiki/Simpson)； 测序深度指数有： Coverage - the Good’s coverage (http://www.mothur.org/wiki/Coverage) 。
各指数算法如下： l Chao： 是用chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。本次分析使用计算公式如下： 其中，
l Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao 1的算法不同。本次分析使用计算公式如下：
其中，
abund =“优势”OTU的阈值，默认为10。 l Simpson：用来估算样本中微生物多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。 其中，
N = 所有的序列数。 l Shannon：用来估算样本中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。 其中，
N = 所有的序列数。 l Coverage ：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。 其中，
N = 抽样中出现的总序列数目。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
输出：
所有指数分析结果列表
分析模块引用了mothur（v.1.35.0）的summary.single命令。
相关文献如下所示： Schloss, P.D., et al., Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol, 2009. 75(23):7537-41. The original tools: Schloss, PD & Handelsman, J. (2006) Introducing SONS, a tool for OTU-based comparisons of membership and structure between microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 72:6773-9. Schloss, PD & Handelsman, J. (2006). Introducing TreeClimber, a test to compare community structures. Applied and Environmental Microbiology. 72: 2379-84. Schloss, PD & Handelsman, J. (2005). Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness. Applied and Environmental Microbiology. 71:1501-6. Schloss, PD, Larget, BR, & Handelsman J. (2004). Integration of microbial ecology and statistics: a test to compare gene libraries. Applied and Environmental Microbiology. 70:5485-92. 群落生态学中研究微生物多样性，通过单样本的多样性分析（Alpha多样性）可以反映微生物群落的丰度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。 计算菌群丰度（Community richness）的指数有： Chao - the Chao1 estimator (http://www.mothur.org/wiki/Chao)； Ace - the ACE estimator (http://www.mothur.org/wiki/Ace)； 计算菌群多样性（Community diversity）的指数有： Shannon - the Shannon index (http://www.mothur.org/wiki/Shannon)； Simpson - the Simpson index (http://www.mothur.org/wiki/Simpson)； 测序深度指数有： Coverage - the Good’s coverage (http://www.mothur.org/wiki/Coverage) 。
各指数算法如下： l Chao： 是用chao1算法估计样本中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。本次分析使用计算公式如下： 其中，
l Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao 1的算法不同。本次分析使用计算公式如下：
其中，
abund =“优势”OTU的阈值，默认为10。 l Simpson：用来估算样本中微生物多样性指数之一，由Edward Hugh Simpson ( 1949) 提出，在生态学中常用来定量描述一个区域的生物多样性。Simpson指数值越大，说明群落多样性越低。 其中，
N = 所有的序列数。 l Shannon：用来估算样本中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。 其中，
N = 所有的序列数。 l Coverage ：是指各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而没有被测出的概率越低。该指数反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。 其中，
N = 抽样中出现的总序列数目。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
输出：
所有指数分析结果列表
分析模块引用了mothur（v.1.35.0）的summary.single命令。
相关文献如下所示： Schloss, P.D., et al., Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol, 2009. 75(23):7537-41. The original tools: Schloss, PD & Handelsman, J. (2006) Introducing SONS, a tool for OTU-based comparisons of membership and structure between microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 72:6773-9. Schloss, PD & Handelsman, J. (2006). Introducing TreeClimber, a test to compare community structures. Applied and Environmental Microbiology. 72: 2379-84. Schloss, PD & Handelsman, J. (2005). Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness. Applied and Environmental Microbiology. 71:1501-6. Schloss, PD, Larget, BR, & Handelsman J. (2004). Integration of microbial ecology and statistics: a test to compare gene libraries. Applied and Environmental Microbiology. 70:5485-92. 分析模块输入OTU Table文件和以OTU代表序列构建的newick-formatted树文件，计算Faith's Phylogenetic多样性指数。其中，newick-formatted树格式文件可由分析模块 "Calculate Faith's Phylogenetic Diversity" 获得。 如果菌落结构具有相同数量的OTU个数和丰度，那么OTU之间在进化树上距离更远（更大序列差异），则对应样品的Faith's Phylogenetic多样性指数将会给出更高的得分。 相较而言，Shannon指数和Simpson指数具有更强的健壮性。
输入：
1、制表符分隔的OTU Table表格文件
2、基于OTU代表序列构建的newick-formatted树文件，可由分析模块 "Calculate Faith's Phylogenetic Diversity" 获得。
输出：
Faith's Phylogenetic多样性指数计算结果
其中，**列为样品名、第二列为PD指数(Faith's Phylogenetic Diversity)、第三列为物种丰富度(species richness)。
分析模块引用R语言（v3.1.0）picante包（1.6.2）中的pd函数进行Faith's Phylogenetic多样性指数计算。
相关文献如下所示： Faith D.P. (1992) Conservation evaluation and phylogenetic diversity. Biological Conservation, 61, 1-10. 稀释性曲线[1]是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计这些个体所代表的物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数据量不同的样本中物种的丰富度，也可以用来说明样本的测序数据量是否合理。采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefaction curve，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量只会产生少量新的OTU，反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可得出样本的测序深度情况。
输入：
制表符分隔的OTU Table表格文件
其他参数默认。
输出：
各样本稀释性曲线图 示例：
注：横坐标：随机抽取的测序数据量；纵坐标：观测到的OTU数量。
分析模块引用了mothur（v.1.35.0）的rarefaction.single命令，利用R语言（v2.12.1）制作曲线图。
相关文献如下所示： [1] Katherine R Amato. et al. Habitat degradation impacts black howler monkey (Alouatta pigra) gastrointestinal microbiomes. The ISME Journal (2013) 7, 1344�C1353; doi:10.1038/ismej. Schloss, P.D., et al., Introducing mothur: Open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Appl Environ Microbiol, 2009. 75(23):7537-41. The original tools: Schloss, PD & Handelsman, J. (2006) Introducing SONS, a tool for OTU-based comparisons of membership and structure between microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 72:6773-9. Schloss, PD & Handelsman, J. (2006). Introducing TreeClimber, a test to compare community structures. Applied and Environmental Microbiology. 72: 2379-84. Schloss, PD & Handelsman, J. (2005). Introducing DOTUR, a computer program for defining operational taxonomic units and estimating species richness. Applied and Environmental Microbiology. 71:1501-6. Schloss, PD, Larget, BR, & Handelsman J. (2004). Integration of microbial ecology and statistics: a test to compare gene libraries. Applied and Environmental Microbiology. 70:5485-92. |
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